Razvoj i unifikacija metoda za analizu i standardizaciju pripravaka inzulina korištenjem reverzno-fazne tekućinske kromatografije (RP HPLC) Pikhtar Anatolij Vasiljevič

• Dijagnostika

Ova disertacija bi trebala uskoro otići u knjižnicu.
Obavijestite o prijemu

Teza - 480 rubalja., Dostava 10 minuta, 24 sata dnevno, sedam dana u tjednu i praznici.

Sažetak - 240 rubalja, dostava 1-3 sata, od 10-19 (moskovsko vrijeme), osim nedjelje

Pihtar Anatolij Vasiljevič. Razvoj i unifikacija metoda za analizu i standardizaciju pripravaka inzulina primjenom reverzno-fazne visokotlačne tekućinske kromatografije (RP HPLC): disertacija. Kandidat za farmaceutske znanosti: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Vasiljevič; [Mjesto zaštite: Moskovska medicinska akademija].- Moskva, 2005.- 139 str.: Il.

Sadržaj disertacije

POGLAVLJE 1. Pregled literature 11

1. Uloga inzulina u liječenju šećerne bolesti 11

2. Biosinteza i biološko djelovanje inzulina 12

3. Opće karakteristike fizikalno-kemijskih i farmaceutskih svojstava inzulina 15

4. Pripravci inzulina 24

5. Metode proizvodnje, standardizacija i kontrola kvalitete pripravaka inzulina 31

6. Upotreba HPLC u farmaceutskoj analizi inzulina. 46

POGLAVLJE 2. Izjava o problemu 50

POGLAVLJE 3. Ispitivanje utjecaja različitih čimbenika na kromatografsko ponašanje inzulina u uvjetima RP HPLC 56

1. Metode i materijali 57

2. Rasprava o rezultatima 62

2.1. Utjecaj sastava puferne otopine 62

2.2. Učinak koncentracije natrijevog sulfata 68

2.3. Učinak temperature kromatografske kolone 70

2.4. Učinak organskog modifikatora 75

2.5. Utjecaj duljine alkilnog radikala cijepljene faze 80

2.6. Utjecaj duljine kromatografske kolone 80

POGLAVLJE 4. Poboljšanje farmakopejskih metoda za analizu pripravaka inzulina na temelju primjene RP HPLC 82

1. Izbor optimalnih uvjeta za kromatografsko određivanje inzulina i njegovih nečistoća u medicinskim pripravcima 82

2. Mjeriteljske značajke metode 84

3. Primjena razvijene metodologije za testiranje službenih pripravaka inzulina 95

POGLAVLJE 5. Razvoj metoda za analizu oblika za injektiranje doziranja izofan-inzulina na temelju PF HPLC metode

1. Izbor uvjeta za kromatografsko određivanje protamina u doznim oblicima izofan-inzulina 110

2. Ispitivanje kromatografskih profila protamina izoliranih iz različitih vrsta riba 121

3. Postupak za određivanje protamina u pripravcima izofan-inzulina 123

4. Validacija razvijene metodologije 125

Opći zaključci t

Literatura 139

Opće značajke fizikalno-kemijskih i farmaceutskih svojstava inzulina

S kemijske točke gledišta, inzulin je mali globularni protein molekulske mase do 6000 Da. Istodobno, treba napomenuti da je inzulin uobičajeni naziv za cijelu obitelj homolognih proteina prirodnog i umjetnog porijekla sa zajedničkom karakterističnom biološkom aktivnošću. Proteinska priroda inzulina uspostavljena je 1928. godine [52]. To je među proteinima koji proizvode biuretnu reakciju i Paulinu reakciju. Struktura inzulina u potpunosti je uspostavljena ranih 50-ih. Elementarni kemijski sastav inzulina različitog podrijetla karakteriziraju brojke dane u tablici 1 [40].

Aminokiselinski sastav. Većina molekula inzulina sadrži 51 aminokiselinski ostatak, među kojima je 17 aminokiselina koje se nalaze u većini poznatih proteina.

Karakteristična značajka aminokiselinskog sastava goveđeg, svinjskog i humanog inzulina je triptofan i metionin. Aminokiselinski sastav ovih vrsta inzulina prikazan je u tablici 2 [40,46].

Nepromjenjiv je kod svih vrsta inzulina sadržaj cistina (6 polu-cistinskih ostataka). Osim toga, molekula inzulina svih vrsta sadrži 6 amidnih skupina (asparagin, glutamin).

Kada se inzulin oslobodi, zajedno s glavnom frakcijom, mogu se uočiti frakcije deamidiranih oblika inzulina. U kiselom okruženju, u procesu deamidacije, može se postupno odvojiti svih 6 amidnih skupina, a elektroforetska i kromatografska pokretljivost promjene inzulina [40]. Formiranje deamidiranih oblika inzulina može se procijeniti na temelju rezultata određivanja amonijaka. Za potpuno amidni oblik inzulina određeno je 6 mol amonijaka na 1 mol proteina, a za deamidirane oblike ova vrijednost može biti od 5 do 0.

Primarna struktura inzulina. Primarnu strukturu inzulina dešifrirala je skupina Sanger 1945-1955. Koristeći brojne kromatografske metode koje su omogućile razdvajanje i identifikaciju različitih peptida, aminokiselina i njihovih derivata, Sanger je uspio ustanoviti primarnu strukturu goveđeg inzulina [130,131,132,133,134,135]. Daljnja istraživanja inzulina različitog podrijetla korištenjem različitih fizikalno-kemijskih metoda, uključujući Edmanovu metodu za određivanje pune sekvence aminokiselina u dugim peptidima, potvrdila su nalaze Sanger-a i njegovih koautora o strukturi inzulina [bb].

Do danas je primarna struktura inzulina određena u predstavnika 24 vrste koje pripadaju 4 klase životinja: sisavaca, ptica, riba i ciklostoma [14]. Istraživanje o inzulinu različitog porijekla nastavlja se [71,72,73].

Struktura inzulina kod različitih životinja je slična, ali nije identična. U svojoj primarnoj strukturi, humani inzulin je sličan svinjskom, pasmom, kitovima i zečjim insulinima, koji se razlikuju samo u jednoj aminokiselini [40]. Razlikuje se od inzulina goveda s tri aminokiseline. Ljudski inzulin u većoj mjeri nije sličan inzulinu gvinejske svinje, ptica i riba [40]. Razlike u aminokiselinskim sekvencama humanih, svinjskih i goveđih inzulina prikazane su u tablici 3.

Unatoč strukturnim razlikama, svi tipovi inzulina imaju sličnu biološku aktivnost, tj. uzrokuju hipoglikemijski učinak. Međutim, veličina prikazane biološke aktivnosti snažno ovisi o vrsti i kreće se od 11 IU / mg (inzulin iz Sjevernog mora) do 62 IU / mg (puran i pileći inzulin), dok je aktivnost humanog inzulina oko 25-30 IU / mg [40]. Što su veće razlike među vrstama, veća je razlika u biološkoj aktivnosti odgovarajućeg inzulina.

Funkcionalno aktivna molekula inzulina sastoji se od dva polipeptidna lanca (A i B lanci) koji su povezani disulfidnim vezama; jedna veza je formirana sa sedmim aminokiselinskim ostacima oba lanca, druga disulfidna veza formirana je pomoću 20. ostatka A-lanca i 19. ostatka B-lanca (Slika 2). Osim toga, u molekuli inzulina postoji i treća disulfidna veza, koja je intračna i povezuje ostatke 6. i 11. lanca A [59,117].

Sekundarna struktura Različitim fizikalno-kemijskim i fizikalnim metodama istraživanja pokazalo se da molekula inzulina ima visoko uređenu prostornu strukturu (konformaciju), što pridonosi provedbi specifičnih bioloških funkcija [14]. U molekuli nativnog inzulina istovremeno su prisutni i cc-helix i p-fold listovi. Osim toga, postoje područja s poremećenom strukturom i strukturom <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Kada se kisela otopina inzulina (pH 2,3-2,5) zagrije na temperaturi od +100 ° C i brzo ohladi na -80 ° C, stvara se tzv. Fibrilarni inzulin - potpuno neaktivan oblik hormona [27]. Uvođenje fibrilarnih inzulinskih vlakana u otopinu aktivnog inzulina uzrokuje spontano kvantitativno taloženje inzulina u obliku fibrila [14,17].

Metode proizvodnje, standardizacija i kontrola kvalitete pripravaka inzulina

Dobivanje životinjskih vrsta inzulina. Industrijska proizvodnja govedine i svinjskog inzulina uspostavljena je gotovo istodobno u nekoliko zemalja, ubrzo nakon otkrića inzulina 1921. godine [63]. Od tada, koncept dobivanja inzulina ostao je gotovo nepromijenjen (tablica b) [17, 18]. Sirovine za proizvodnju životinjskih vrsta inzulina su goveda gušterača koja se koristi za ishranu.

Najvažniji zadatak u proizvodnji inzulina je njegovo pročišćavanje - oslobađanje tvari iz srodnih nečistoća, koje smanjuju biološku aktivnost, uzrokuju imunološke reakcije ili su potencijalno opasne za zdravlje pacijenta. Na primjer, nakon nekoliko godina korištenja slabo pročišćenog inzulina u krvi pacijenta, može postojati do 5.000 IU inzulina vezanog na antitijela. Antitijela na inzulin značajno utječu na profil njezina djelovanja i time pridonose labilnom tijeku dijabetesa.

Prva metoda pročišćavanja inzulina bila je rekristalizacija u prisutnosti cinkovih soli. Godine 1945. pokazalo se da sedmostruka rekristalizacija inzulina značajno smanjuje razinu alergijskih reakcija u bolesnika u usporedbi sa službenim inzulinskim preparatima u to vrijeme [63].

Heterogenost uzoraka inzulina nakon kristalizacije i pojedinačne rekristalizacije prikazana je različitim metodama: protustrujna ekstrakcija (PE), distribucijska kromatografija (PX), ionsko-izmjenjivačka kromatografija (IOC), diskelektroforeza (DEP) i gel-kromatografija (GEC) [63].,

Utvrđeno je da su glavne popratne inzulinske nečistoće: proinzulin, njegovi međuprodukti, kovalentni dimer inzulina, mono-disamido inzulin, monoarginin i mono-etilen, kao i brojni visoko-molekularni spojevi koji nisu insulina. Opći zaključak iz rezultata istraživanja, uzimajući u obzir podatke o imunološkoj aktivnosti detektiranih nečistoća [138], bio je zaključak o potrebi dodatnog pročišćavanja inzulinskih tvari, tako da je pri analizi DEF i GEC metodama nađena jedna komponenta - odgovarajući inzulin.

Kako bi se riješio problem pročišćavanja inzulina 1950. godine, predložena je HEC metoda, a 1970. metoda anionske izmjene (AOX). Utvrđeno je da inzulin, pročišćen metodom AOX, sadrži oko 500 ppm (dijelova na milijun) nečistoća s aktivnošću proinzulina [137]. Dodatno pročišćavanje inzulina pomoću visokotlačne tekućinske kromatografije na obrnutim fazama (RP HPLC) smanjuje sadržaj imunogenih frakcija do granice njihove detekcije [63].

Pregled aktualnog razvoja na području kromatografskog pročišćavanja inzulina prikazan je u [96]. Inzulin, sekvencijalno pročišćen, koristeći IOC i GEC, naziva se monokomponentni inzulin [63]. Dobivanje humanog inzulina. Potraga za metodama za dobivanje humanog inzulina nastala je zbog dvije okolnosti. S jedne strane, hitnost sirovinskog problema u slučaju proizvodnje životinjskog inzulina, s druge strane, brzi razvoj znanosti u ovom području pružio je pravu priliku za život. 1979. i 1981 gotovo istodobno su razvijene dvije metode dobivanja humanog inzulina - biosintetski i polusintetski [102,108]. Godine 1981. tvrtka Novo Nordisk po prvi put u svijetu započela je serijsku proizvodnju ljudskog polusintetičkog inzulina. Metoda koju tvrtka koristi temelji se na enzimatskoj i kemijskoj zamjeni Al u molekuli svinjskog inzulina s ostatkom Tre [61]. Ova metoda izravno ovisi o dobivanju potrebne količine svinjskog inzulina, što smanjuje njegovu ekonomsku vrijednost. Mogućnost dobivanja humanog inzulina biosintetskom metodom pojavila se s razvojem tehnologije rekombinantne DNA [10]. Radovi na proizvodnji genetski modificiranog inzulina započeli su prije 25 godina. 1978. objavljeno je da je dobiven soj proinsou-ling štakora koji proizvodi E. coli. Godine 1979. Genentechove studije su mogle klonirati u E. coli gene za kodiranje aminokiselinskih sekvenci. inzulinski lanci A i B uključeni u p-halo-tacidaznu regiju plazmida pBR322 [10,102]. 1981. sintetiziran je proinzulinski gen-analog mini-C-proinzulina, u kojem je 35-člani C-peptid zamijenjen segmentom od šest aminokiselina: arg-arg-gly-ser-lys-arg i njegova ekspresija u E. coli. Godine 1982. Eli Lilly pokrenuo je prvu svjetsku industrijsku proizvodnju ljudskog inzulina koristeći tehnologiju dva lanca razvijenu u suradnji s Genentechom [102]. Trenutno je prikazana mogućnost dobivanja humanog inzulina uz pomoć različitih ekspresijskih sustava [3,10,101,102]. S ekonomskog stajališta, od posebne je važnosti uporaba genetski modificiranih sojeva gram-pozitivnih bakterija E.coli, od kojih se mnogi smatraju prekomjernim proizvodima [3]. Istovremeno je postignut značajan napredak kod stanica kvasca Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tablica 7 navodi glavne, zajedničke za različite metode proizvodnje rekombinantnog humanog inzulina, faze tehnološkog procesa [3,10,63].

Primjena razvijene metodologije ispitivanja službenih pripravaka inzulina

Visokotlačna tekućinska kromatografija (HPLC) je varijanta kolonske tekućinske kromatografije u kojoj mobilna faza - eluent - prolazi kroz sorbent ispunjavajući kolonu velikom brzinom zbog značajnog pritiska (do 400x105 Pa) na ulazu u kolonu [11].

Kao način analize složenih smjesa tvari, HPLC se pojavio prije nešto više od 30 godina. Primjena sorbenata promjera čestica od 3 - 10 μm uzrokovala je naglo povećanje učinkovitosti kromatografskog razdvajanja u usporedbi s klasičnom verzijom kolonske tekućinske kromatografije. Stoga se HPLC često naziva tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC). Instrumentalna obilježja primjene HPLC detaljno su opisana u brojnim priručnicima [49.50] i relevantnim odjeljcima vodeće farmakopeje [79,150]. Za HPLC je razvijen i proizvodi se širok raspon sorbenata. Prema autorima istraživanja [51] - oko 100 tvrtki širom svijeta proizvodi više od 300 vrsta imena sorbenta. Povijest, trenutno stanje i izgledi za razvoj metode opisani su u pregledima [51] i [77.78].

U različitim varijantama, HPLC metoda se široko koristi u farmaceutskoj analizi (kontrola proizvodnje i ispitivanje kvalitete lijeka). Metoda je uključena u sve vodeće farmakopeje svijeta. Ova metoda je najpotpunije opisana u Europskoj i Američkoj farmakopeji. HPLC se koristi za identifikaciju lijekova, za određivanje čistoće, frakcijskog sastava molekularne mase i kvantitativne analize. U US Pharmacopoeia 28 ed. oko 30% privatnih artikala uključuje korištenje HPLC. U Europskoj farmakopeji 4. izd. ova brojka je oko 40%.

Prva kromatografska metoda za ispitivanje inzulina bila je niskotlačna gel isključiva tekuća kromatografija (GE ZhND). Princip odvajanja pod uvjetima HPLC-a temelji se na različitoj sposobnosti molekula različitih veličina da prodiru u pore neutralnog gela, koji služi kao stacionarna faza. Hidrodinamički promjer inzulinskog monomera i dimera proporcionalan je njihovoj molekularnoj težini i iznosi 2,69 odnosno 5,50 nm [115].

Godine 1967. primjenom GE-IHDD metode pokazalo se da komercijalni pripravci inzulina, pročišćeni kristalizacijom, sadrže nečistoće molekulske mase veće od molekularne težine inzulina [63]. Na kromatogramu svinjskog inzulina nađena su tri pika, koji su uobičajeno označeni kao a-, b- i c-komponente. Od tada je predloženo više kromatografskih sustava za kontrolu sadržaja nečistoća visoke molekularne mase u pripravcima inzulina. Odvajanje je provedeno na visoko bubrićim agaroznim kserogelima (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Ili dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M otopine octene kiseline korišteni su kao IF [127]. Visoka osjetljivost ovih sorbenata na kompresiju pri tlaku koji prelazi tlak bubrenja matriksa čini te materijale neprikladnim za rad u HPLC modu.

Korištenje gel-ekskluzivne tekućinske kromatografije pri visokim tlakovima (GE HPLC) za analizu inzulina prvi je opisan 1980. godine, nakon razvoja tvrdih makroporoznih sorbenata kompatibilnih s vodom i izdržanih visokih tlakova. U [151], odvajanje je provedeno na kolonama Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) u uvjetima denaturacije (kombinacija 7 M otopine uree, mineralnih kiselina i neionskih). sredstva za čišćenje). Potreba za analizom inzulina u uvjetima denaturiranja povezana je sa sposobnošću inzulina da se agregira u otopini. Za odvajanje inzulina u uvjetima HPLC HPLC, također je opisana upotreba "tradicionalne" eluens octene kiseline [152]. Upotreba octene kiseline ima nekoliko prednosti - minimalan utjecaj na nativnu strukturu odvojenih spojeva, dostupnost, nisku cijenu, osim toga, važna činjenica je sposobnost octene kiseline da suprimira povezanost inzulina.

Trenutno je HPLC ghvd farmakopejska metoda za praćenje sadržaja nečistoća visoke molekularne mase u supstancama i gotovim oblicima doziranja. Metoda se također koristi za određivanje sadržaja protamina u pripravcima izofan-inzulina.

Korištenje HPLC na obrnutim fazama (RP HPLC) za razdvajanje goveda i svinjskog inzulina po prvi put pokazalo je visoku učinkovitost ove metode za analizu peptida sličnih inzulinu sa sličnom strukturom.

Mehanizam razdvajanja proteina i polipeptida u uvjetima RP HPLC temelji se na različitoj hidrofobnosti molekula inzulina i srodnih nečistoća. Do danas je opisano nekoliko desetaka metoda za kromatografsko razdvajanje inzulina različitog porijekla i njihovih derivata, uključujući proin-sulin, polipeptide gušterače, derivate dezamida, dimer inzulina. [126] pokazala je mogućnost odvajanja inzulina od piletine, zeca, ovaca i konja. Ljudski, goveđi i svinjski inzulin također su razdvojeni. Lloyd i Corran objavili su metodu za odvajanje govedine, svinjetine, humanih inzulina i njihovih odgovarajućih deamidiranih oblika [104].

Odvajanje se provodi na sorbetima silika gela modificirane, metil, butil, oktil, oktadecil i fenil skupine u izokratskom ili gradijentnom modu. Kao PF koriste se organski modifikatori - acetonitril, metil alkohol, izopropilni alkohol, pomiješani s vodenim puferskim otopinama koje sadrže anorganske soli i ionske pare. Detekcija vrha provodi se uglavnom spektrofotometrijskom metodom na valnoj duljini 190-220 nm, a opisane su i fluorimetrijske metode [103].

Analiza supstance i gotovih oblika doziranja inzulina pomoću RP HPLC opisana je u privatnim člancima u Američkoj i Europskoj farmakopeji [79,150]. Metoda se koristi za testiranje lijekova određene skupine u smislu "inzulinske autentičnosti", "srodnih proteina", "kvantitativnog određivanja" i "inzulina u otopini".

Istraživačka literatura također opisuje uporabu ionsko-izmjenjivačke i afinitetne kromatografije za analizu inzulina [44,102], međutim, te metode nisu naširoko korištene u farmakopejskoj praksi.

Izbor uvjeta za kromatografsko određivanje protamina u doznim oblicima izofan-inzulina

Povećanje ionske jakosti PF-a obično dovodi do povećanja omjera inzulinskih kapaciteta, što može biti uzrokovano brojnim čimbenicima: - povećanje koncentracije iona smanjuje stupanj ionizacije nabijenih skupina molekule proteina, povećavajući njegovu hidrofobnost / - visoka koncentracija kationa doprinosi probiranju slobodnih silanolnih skupina na površini faza koja slabi nespecifičnu elektrostatičku interakciju protoniranih amino skupina proteina s matricom; - visoka ionska snaga utječe na prostornu strukturu inzulina, što rezultira promjenom površine za interakciju sa sorbensom. Koncentracija anorganskih soli u FS utječe na oblik pikova i selektivnost odvajanja inzulina i desamido-Asn-inzulina [143, 144]. Sa izokratskim eluiranjem na sorbentu LiChrosorb Sív s 0,1 M otopinom natrijevog fosfata (pH 2,3), postignut je zadovoljavajući rezultat samo kada je natrijev sulfat dodan u otopinu pufera do koncentracije 0,1 M. Većina metoda analize inzulina uključenih u farmakopejske proizvode i ND, PF koristiti na osnovi pufernih otopina s sadržajem natrij sulfata jednakim 0,2 M. Takav visok sadržaj natrijevog sulfata negativno utječe na obnovljivost rezultata kromatografije zbog raslojavanja eluenata, štoviše, visoko koncentrirane otopine soli imaju negativan učinak na kromatografsku opremu, skraćujući njen vijek trajanja. S obzirom da su farmakopejske metode analize razvijene prije više od 20 godina, činilo se zanimljivim proučiti kromatografsko ponašanje inzulina pod OF-HPLC na kromatografskim sorbentima najnovije generacije, ovisno o koncentraciji natrijevog sulfata. Istodobno su pokušali otkriti je li dopušteno smanjenje sadržaja natrijevog sulfata u PF bez značajnog pogoršanja sposobnosti odvajanja kromatografskog sustava. Kao rezultat istraživanja utvrđeno je da je učinak koncentracije natrijevog sulfata u PF različit, ovisno o tipu cijepljene faze, kao io vrsti inzulina. Na sorbentima s cijepljenim skupinama C4 i C selektivnost odvajanja pikova humanog inzulina i desamido-Asn-humanog inzulina ne ovisi o koncentraciji natrijevog sulfata u. otopina pufera 1 u rasponu od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbensu Diaspher-110-C18, selektivnost odvajanja ovog para vrhova ima maksimum na 0,05 M i minimum na 0,1 M (grafikon 4). S druge strane, selektivnost odvajanja životinjskih vrsta inzulina i njihovih odgovarajućih desamidiranih AsnA21 oblika ne ovisi o ionskoj jakosti otopine kada je odvojena na sorbensu Diasphere-110-C18. Na sorbensu s C8 cijepljenim skupinama, selektivnost se povećava od 1,25 do 1,28 s povećanjem koncentracije natrij sulfata (slika 4). Na sorbentu s C4 cijepljenim skupinama, selektivnost separacije u slučaju goveđeg inzulina je maksimalna na 0,1 M natrijevog sulfata i minimalna na 0,2 M. Za svinjski inzulin nema izraženog maksimuma pri koncentraciji natrij sulfata od 0,1 M, u ovom slučaju povećanje ionskog sile su dovele do smanjenja selektivnosti odvajanja (slika 4). Broj učinkovitih teoretskih ploča povećava se s povećanjem koncentracije natrij sulfata. Izuzetak je ponašanje humanog inzulina na sorbensu Diasfer-110-C8 (slika 5). Stupanj razdvajanja pikova inzulina i desamido-Asn-inzulina raste s povećanjem ionske jakosti FS-a, bez obzira na vrstu inzulina i vrstu cijepljene faze (dijagram b). Smanjenjem koncentracije natrij sulfata od 0,2 M do 0,1 M, stupanj odvajanja odabranog para vrhova smanjuje se u prosjeku za 5% za humane i svinjske inzuline, te za 10% za goveđi inzulin. Uzimajući u obzir činjenicu da apsolutna vrijednost stupnja odvajanja prelazi 2,0, izmjerena pogoršanje kapaciteta odvajanja kolone, po našem mišljenju, nije značajno. Prema tome, koncentracija natrijevog sulfata u puferskoj otopini PF može se smanjiti 2 puta u usporedbi s farmakopejskim metodama analize.

U većini studija o analizi proteina i peptida, odvajanje se provodi na sobnoj temperaturi. Štoviše, neki autori ukazuju da je utjecaj temperature na selektivnost odvajanja minimalan [48]. Međutim, s porastom temperature ubrzava se proces razmjene masa između stacionarnih i pokretnih faza, što dovodi do smanjenja vremena zadržavanja peptida i sužavanja vrhova.

Inzulin je standardiziran

Gušterača je jedan od najvažnijih organa s dvostrukom sekrecijom - unutarnjom i vanjskom.
Proizvod unutarnjeg izlučivanja je inzulin, koji igra važnu ulogu u metabolizmu ugljikohidrata. Inzulin je proizvod posebne vrste stanica grupiranih u tzv. Langerhansove otoke.

Eksterna tajna je sok gušterače koji sadrži tripsin - jedan od najvažnijih probavnih enzima, koji izlučuju žlijezde koje čine glavnu masu gušterače. Tripsin je glavni dio pripravka pankreatina.
Inzulin (Insulinum). Inzulin je izoliran u čistom obliku 1921. godine. Postoji mnogo načina za njegovu proizvodnju, koji se razlikuju jedni od drugih uglavnom samo u detaljima.

Zbog činjenice da se, osim inzulina, u gušterači nalazi i enzim tripsin, koji vrlo lako lomi inzulin, prvi pokušaji dobivanja inzulina iz gušterače nisu uspjeli. Stoga smo ga pokušali dobiti iz žlijezde u kojoj bi taj enzim bio odsutan, primjerice iz žlijezda riba ili intrauterinih teladi. Ali čak ni ovi pokušaji uspjeha u proizvodnji nisu imali, jer je u ribama veličina žlijezde vrlo mala i tehnički je teško izolirati samu žlijezdu; ekstrakcija žlijezda od intrauterinih teladi u velikim količinama za proizvodnju predstavlja znatne poteškoće.
Konačno, 1922. eksperimenti sa žlijezdama zrelog goveda pokazali su da se kod uporabe zakiseljenog jakog alkohola enzimi (tripsin, itd.) Inaktiviraju i gube sposobnost uništavanja inzulina.

Tehnološka shema proizvodnje. Za proizvodnju inzulina koristi se smrznuta ili svježa gušterača uglavnom od goveda i svinja.
Rezanje. Kako bi se izbjeglo uništavanje hormona tripsinom, svježe žlijezde najkasnije 30 minuta nakon klanja životinje treba očistiti od susjednih tkiva, smrvljenog u mesnoj mesari.

Vađenje. Smrvljene žlijezde se preliju s 95% -tnim alkoholom, zakiselim sa sumpornom kiselinom (1 dio žlijezde je 1,5 dijela alkohola 95 ° bez aldehida + 0,5% sumporne ili klorovodične kiseline). Smjesa je ekstrahirana hlađenjem 1.5 sat uz stalno miješanje.
Prvi ekstrakt se isprazni, ostatak se iscijedi ili centrifugira. Ekstrakcija se opet ekstrahira s 1 satom 60 ° alkohola (a ne 95 °, jer nema vlage u sirovini) - jedan dio žlijezde uzima jedan dio alkohola. Oba ekstrakta se zajedno ispuštaju i filtriraju kroz foliju.

Uklanjanje balastnih proteina. Iz dobivenog ekstrakta proteini se uklanjaju na različite načine:
1) taloženjem na hladnom (od -4 do 0 ° C) unutar 48 sati.
2) dodati ekstraktu natrijev hidroksid do pH 6,6 - 6,8 (u nekim slučajevima - do pH = 6,4 - 6,6).

Precipitacija se odvaja pomoću centrifuge, filtracije ili taloženja.
Isparavanje i odmašćivanje. Dobivena bistra tekućina se zakiseli sa čistom sumpornom kiselinom do pH = 2,5 i podvrgne uparavanju do 1/10 volumena na temperaturi ne višoj od 40 ° C.
Nakon uklanjanja svih alkohola, tekućina se odmašćuje.

Soljenje i čišćenje. Amonijev sulfat se dodaje u odmašćeni filtrat do zasićenja, nakon čega se pojavljuje inzulin s malom količinom balastnih tvari, tvoreći koru sirovog inzulina, koja se uklanja i suši, a zatim se odmaščuje sa smjesom alkohola i etera.
Odmašćeni inzulin se suši u uvjetima okoline i melje do praha. Prašci cvjetanja podvrgavaju se daljnjem pročišćavanju da se dobije kristalni inzulin koji sadrži najmanje 22 U u 1 mg.
Standardizacija. Dobiveni inzulin je bijeli ili blago sivkasti prah. Topiv je u vodi i vodenoj otopini alkohola do 80 °, ali je netopljiv u alkoholu s tvrđavom iznad 90 °. Kada se inzulin otopi u vodi, dobiva se bezbojna ili blago žućkasta tekućina.

Za konzerviranje, otopini se doda 0,3% tricrezola ili fenola i podvrgne biološkoj standardizaciji. Kada se inzulin ubrizga u zečeve, njihov sadržaj ugljikohidrata u krvi od 1,5 do 5 sati treba smanjiti u prosjeku za 50%, tj. Od 0,09 do 0,045% (vidi Farmakopeja, 9. izdanje). Odgovarajuća doza naziva se jedna zečja jedinica, koja je jednaka tri ljudske ili tri kliničke.
Pakiranje. Otopina se propušta kroz bakterijski filter. Zatim se filtrat izlije u aseptičnom okruženju u boce od 5 ili 10 ml u svakom mililitru otopine inzulina treba sadržavati 40 ili 80 U.

Bočice se zatvaraju gumenim čepovima koji se valjaju s aluminijskim čepovima.
Naljepnice se stavljaju na boce i na kutiju s bocama, na kojima treba naznačiti aktivnost pripreme, datum proizvodnje, rok trajanja, itd.

Prije uporabe inzulina, aluminijska kapica se otvori, obriše se alkoholom, zatim se probuši pluta sterilnom iglom, a potrebnu količinu tekućine usisamo u štrcaljku, koja se ubrizgava subkutano ili intramuskularno.
Skladištenje. Inzulin se sprema u bočice. Rok trajanja je 18 mjeseci na temperaturi ne višoj od 10 ° C, budući da pri višoj temperaturi inzulin može djelomično izgubiti aktivnost.

Vanjski znakovi neprikladnosti: zamućenje otopine ili taloženja, pojava plijesni unutar bočica ili kolonija mikroorganizama.

Farmakološka skupina - inzulini

Pripreme podskupina su isključene. omogućiti

opis

Inzulin (iz latinskog. Insula - otočić) je protein-peptidni hormon kojeg proizvode β-stanice Langerhansovih otočića pankreasa. Pod fiziološkim uvjetima, P-stanice inzulin se formira iz preproinzulina, jedno-lančanog prekursorskog proteina koji se sastoji od 110 aminokiselinskih ostataka. Nakon što se grubi endoplazmatski retikulum prenese kroz membranu, signalni peptid od 24 aminokiseline se odcijepi od preproinzulina i formira se proinzulin. Dugi lanac proinzulina u Golgijevom aparatu je pakiran u granulama, gdje se kao rezultat hidrolize odvajaju četiri glavna aminokiselinska ostatka u obliku inzulina i C-terminalnog peptida (fiziološka funkcija C-peptida je nepoznata).

Molekula inzulina se sastoji od dva polipeptidna lanca. Jedan od njih sadrži 21 aminokiselinski ostatak (lanac A), drugi - 30 aminokiselinskih ostataka (lanac B). Lanci su povezani dvama disulfidnim mostovima. Treći disulfidni most se formira unutar lanca A. Ukupna molekulska masa molekule inzulina je oko 5700. Aminokiselinska sekvenca inzulina smatra se konzervativnom. Većina vrsta ima jedan inzulinski gen koji kodira jedan protein. Iznimka su štakori i miševi (oni imaju dva gena inzulina), oni proizvode dva inzulina, koji se razlikuju u dva aminokiselinska ostatka B-lanca.

Primarna struktura inzulina u različitim biološkim vrstama, uklj. i kod različitih sisavaca, nešto drugačije. Najbliže strukturi humanog inzulina je svinjski inzulin, koji se razlikuje od ljudskog, aminokiselinom (ona ima ostatak alanina u lancu B umjesto aminokiselinskog ostatka treonina). Goveđi inzulin razlikuje se od ljudskih aminokiselinskih ostataka.

Povijesna pozadina. Godine 1921. Frederick G. Banting i Charles G. Best, koji rade u laboratoriju Johna J. R. McLeoda na Sveučilištu u Torontu, izvadili su ekstrakt iz gušterače (kako se kasnije pokazalo da sadrži amorfni inzulin), što je smanjilo razinu glukoze u krvi kod pasa s eksperimentalnim dijabetesom. Godine 1922. ekstrakt gušterače ubrizgan je u prvog pacijenta, 14-godišnjeg Leonarda Thompsona, koji ima dijabetes, i tako mu je spasio život. Godine 1923. James B. Collip razvio je metodu za pročišćavanje ekstrakta iz gušterače, koji je kasnije omogućio pripremu aktivnih ekstrakata iz žlijezda gušterače svinja i goveda, koji daju ponovljive rezultate. Godine 1923. Banting i McLeod dobili su Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu za otkriće inzulina. Godine 1926. J. Abel i V. Du-Vigno su dobili inzulin u kristalnom obliku. Godine 1939. inzulin je prvi put odobrio FDA (Uprava za hranu i lijekove). Frederick Sanger potpuno je dešifrirao aminokiselinski slijed inzulina (1949.-1954.), A 1958. Sanger je dobio Nobelovu nagradu za svoj rad na dešifriranju strukture proteina, osobito inzulina. 1963. sintetiziran je umjetni inzulin. Prvi rekombinantni humani inzulin odobren je od FDA 1982. godine. FDA je odobrila analog ultrazvučno djelujućeg inzulina (lispro inzulin) 1996. godine.

Mehanizam djelovanja. U provođenju učinaka inzulina vodeću ulogu ima njegova interakcija sa specifičnim receptorima lokaliziranim na plazmatskoj membrani stanice, te stvaranje inzulin-receptorskog kompleksa. U kombinaciji s inzulinskim receptorom, inzulin ulazi u stanicu, gdje utječe na fosforilaciju staničnih proteina i aktivira brojne unutarstanične reakcije.

Kod sisavaca, receptori inzulina nalaze se na gotovo svim stanicama, kako na klasičnim ciljnim stanicama inzulina (hepatociti, miociti, lipociti), tako i na krvnim stanicama, mozgu i spolnim žlijezdama. Broj receptora na različitim stanicama varira od 40 (eritrocita) do 300 tisuća (hepatociti i lipociti). Receptor inzulina se stalno sintetizira i razlaže, njegov poluživot je 7-12 sati.

Inzulinski receptor je veliki transmembranski glikoprotein koji se sastoji od dvije a-podjedinice s molekulskom masom od 135 kDa (svaka sadrži 719 ili 731 aminokiselinskih ostataka ovisno o spajanju mRNA) i dvije P-podjedinice s molekulskom masom od 95 kDa (620 aminokiselinskih ostataka). Podjedinice su međusobno povezane disulfidnim vezama i tvore heterotetramernu strukturu β-α-α-β. Alfa podjedinice su locirane izvanstanično i sadrže mjesta za vezanje inzulina, što je dio prepoznavanja receptora. Beta podjedinice tvore transmembransku domenu, posjeduju aktivnost tirozin kinaze i obavljaju funkciju konverzije signala. Vezanje inzulina na a-podjedinicu inzulinskog receptora dovodi do stimulacije tirozin-kinazne aktivnosti β-podjedinica autofosforiliranjem njihovih tirozinskih ostataka, dolazi do agregacije α, β-heterodimera i brze internalizacije kompleksa hormonskih receptora. Aktivirani receptor inzulina pokreće kaskadu biokemijskih reakcija, uklj. fosforilacija drugih proteina unutar stanice. Prva od tih reakcija je fosforilacija četiriju proteina, koji se nazivaju supstrati inzulinskih receptora (inzulin receptorski supstrat), IRS-1, IRS-2, IRS-3 i IRS-4.

Farmakološki učinci inzulina. Inzulin utječe na gotovo sve organe i tkiva. Međutim, njegove glavne mete su jetra, mišić i masno tkivo.

Endogeni inzulin je najvažniji regulator metabolizma ugljikohidrata, egzogeni inzulin je specifično sredstvo za smanjenje šećera. Učinak inzulina na metabolizam ugljikohidrata posljedica je činjenice da povećava transport glukoze kroz staničnu membranu i njegovo korištenje od strane tkiva, doprinosi pretvaranju glukoze u glikogen u jetri. Osim toga, inzulin inhibira endogenu proizvodnju glukoze suzbijanjem glikogenolize (razgradnje glikogena do glukoze) i glukoneogeneze (sinteza glukoze iz izvora koji nisu ugljikohidrati - na primjer, iz aminokiselina, masnih kiselina). Osim hipoglikemije, inzulin ima i brojne druge učinke.

Učinak inzulina na metabolizam masti očituje se u inhibiciji lipolize, što dovodi do smanjenja protoka slobodnih masnih kiselina u krvotok. Inzulin sprječava stvaranje ketonskih tijela u tijelu. Inzulin pojačava sintezu masnih kiselina i njihovu kasniju esterifikaciju.

Inzulin sudjeluje u metabolizmu proteina: povećava prijenos aminokiselina preko stanične membrane, stimulira sintezu peptida, smanjuje potrošnju proteina u tkivima i inhibira pretvorbu aminokiselina u keto kiseline.

Djelovanje inzulina praćeno je aktivacijom ili inhibicijom brojnih enzima: stimulira se glikogen sintetaza, piruvat dehidrogenaza, heksokinaza, inhibiraju se lipaze (i hidroliziraju lipidi masnog tkiva i lipoprotein lipaza koja smanjuje zamućenje seruma nakon uzimanja hrane visoke masnoće).

U fiziološkoj regulaciji biosinteze i izlučivanja inzulina u gušterači koncentracija glukoze u krvi ima važnu ulogu: s povećanjem sadržaja, izlučivanje inzulina se povećava, a sa smanjenjem usporava. Na izlučivanje inzulina, osim na glukozu, utječu elektroliti (osobito ioni Ca 2+), aminokiseline (uključujući leucin i arginin), glukagon, somatostatin.

Farmakokinetika. Inzulinski pripravci se ubrizgavaju s / c, intramuskularno ili intravenozno (u / u, daju se samo kratkodjelujući inzulini, i to samo u dijabetičkoj prekomi i komi). Nemoguće je ući u / u suspenzije inzulina. Temperatura inzulina trebala bi biti na sobnoj temperaturi hladan inzulin se apsorbira sporije. Najoptimalniji način kontinuirane terapije inzulinom u kliničkoj praksi je uvod.

Potpuna apsorpcija i početak djelovanja inzulina ovise o mjestu ubrizgavanja (obično se inzulin ubrizgava u trbuh, bedra, stražnjicu, nadlakticu), dozu (volumen injekcije inzulina), koncentraciju inzulina u pripravku itd.

Brzina apsorpcije inzulina u krv iz mjesta injiciranja ovisi o brojnim čimbenicima - kao što su inzulin, mjesto ubrizgavanja, lokalna brzina protoka krvi, lokalna mišićna aktivnost, količina ubrizganog inzulina (preporučuje se da se na jednom mjestu ne ubrizga više od 12-16 U lijeka). Najbrže, inzulin ulazi u krv iz potkožnog tkiva prednjeg trbušnog zida, sporije od ramena, prednje površine bedra, pa čak i sporije od subscapularis i stražnjice. To je zbog stupnja vaskularizacije potkožnog masnog tkiva navedenih područja. Profil djelovanja inzulina podložan je značajnim fluktuacijama i kod različitih ljudi i kod iste osobe.

U krvi se inzulin veže za alfa i beta globuline, normalno 5-25%, ali se vezanje može povećati tijekom liječenja zbog pojave serumskih antitijela (proizvodnja antitijela na egzogeni inzulin dovodi do rezistencije na inzulin; uz primjenu suvremenih visoko pročišćenih pripravaka rijetko dolazi do rezistencije inzulina; ). T_1/2 krvi je manje od 10 min. Većina inzulina koji se otpušta u krvotok ima proteolitičku razgradnju u jetri i bubrezima. Brzo se izlučuje putem bubrega (60%) i jetre (40%); manje od 1,5% se izlučuje u urinu nepromijenjeno.

Pripravci inzulina koji se trenutno koriste razlikuju se na nekoliko načina, uključujući i prema izvoru podrijetla, trajanju djelovanja, pH otopine (kiselo i neutralno), prisutnosti konzervansa (fenol, krezol, fenol-krezol, metil paraben), koncentracija inzulina - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Klasifikacija. Insulini se obično klasificiraju prema podrijetlu (goveđi, svinjski, ljudski, kao i analozi humanog inzulina) i trajanje djelovanja.

Ovisno o izvorima proizvodnje, razlikuju se inzulini životinjskog podrijetla (uglavnom pripravci svinjskog inzulina), polu-sintetski pripravci humanog inzulina (dobiveni od enzimske transformacije svinjskog inzulina), preparati humani-inzulin (DNA-rekombinant, proizvedeni genetskim inženjeringom).

Za medicinsku uporabu, inzulin je prethodno dobiven uglavnom iz gušterače goveda, zatim iz gušterače žlijezda svinja, s obzirom da je svinjski inzulin bliži humanom inzulinu. Budući da se goveđi inzulin, koji se razlikuje od tri humane aminokiseline, često uzrokuje alergijske reakcije, danas se praktički ne koristi. Svinjski inzulin koji se razlikuje od ljudske jedne aminokiseline, manje je vjerojatno da će izazvati alergijske reakcije. U inzulinskim medicinskim pripravcima, ako nema dovoljno pročišćavanja, mogu biti prisutne nečistoće (proinzulin, glukagon, somatostatin, proteini, polipeptidi) koji mogu uzrokovati različite sporedne reakcije. Moderne tehnologije omogućuju dobivanje pročišćenog (mono-peak-hromatografski pročišćenog otpuštanja "vrha" inzulina), visoko pročišćenih (monokomponentnih) i kristaliziranih pripravaka inzulina. Od pripravaka inzulina životinjskog podrijetla prednost se daje mono-vršnom inzulinu izvedenom iz gušterače svinja. Inzulin dobiven genetskim inženjeringom u potpunosti je u skladu s aminokiselinskim sastavom humanog inzulina.

Aktivnost inzulina određuje se biološkom metodom (prema sposobnosti snižavanja glukoze u krvi kod kunića) ili fizikalno-kemijskom metodom (elektroforezom na papiru ili kromatografijom na papiru). Za jednu jedinicu djelovanja, ili međunarodnu jedinicu, uzmite aktivnost od 0,04082 mg kristalnog inzulina. Ljudska gušterača sadrži do 8 mg inzulina (približno 200 U).

Pripravci inzulina podijeljeni su na kratke i ultra kratke lijekove - oponašaju normalnu fiziološku sekreciju inzulina u gušterači kao odgovor na stimulaciju, lijekove prosječnog trajanja i dugodjelujuće lijekove - oponašaju bazalno (pozadinsko) izlučivanje inzulina, kao i kombinirane lijekove (kombinirati oba djelovanja).,

Postoje sljedeće grupe:

Ultrashort-djelovanje inzulina (hipoglikemijski učinak razvija se 10-20 minuta nakon s / c injekcije, vrhunac djelovanja doseže se u prosjeku nakon 1-3 sata, trajanje djelovanja je 3–5 sati):

- inzulin lispro (Humalog);

- inzulin aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- inzulin glulisin (apidra).

Inzulini kratkog djelovanja (početak djelovanja obično nakon 30-60 minuta; maksimalno djelovanje nakon 2-4 sata; trajanje djelovanja do 6–8 sati):

- topljivi inzulin [ljudski genetski inženjering] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Redoviti);

- topljivi inzulin [humani polusintetski] (Biogulin R, Humodar R);

- topljivi inzulin [monokomponenta svinje] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Pripravci inzulina dugog djelovanja - uključuju lijekove prosječnog trajanja djelovanja i lijekove s dugim djelovanjem.

Insulini srednjeg trajanja djelovanja (početak nakon 1,5–2 h; vrhunac nakon 3–12 sati; trajanje 8–12 h):

- Inzulin-izofan [ljudski genetski inženjering] (Biosulin N, Gansulin N, Gensulin N, Insuman Bazal GT, Insuran NPH, Protafan NM, Rinsulin NPH, Humulin NPH);

- inzulin-izofan [humani polusintetski] (Biogulin N, Humodar B);

- inzulin-izofan [monokomponenta svinje] (Monodar B, Protafan MS);

- suspenzije inzulinskog cinkovog spoja (Monotard MS).

Dugodjelujući inzulini (početak nakon 4–8 h; vrhunac nakon 8-18 sati; ukupno trajanje 20-30 h):

- inzulin glargin (Lantus);

- inzulin detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Kombinirani pripravci inzulina (dvofazni pripravci) (hipoglikemijski učinak počinje 30 minuta nakon primjene s / c, dostiže maksimum nakon 2 do 8 sati i traje do 18-20 sati):

- dvofazni inzulin [humani polusintetski] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- dvofazni inzulin [genetski modificirani čovjek] (Gansulin 30P, Gensulin M30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- bipazni inzulin aspart (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Ultrashort-djelovanjem inzulini su humani inzulinski analozi. Poznato je da su endogeni inzulin u β-stanicama gušterače, kao i molekule hormona u proizvedenim otopinama inzulina kratkog djelovanja, polimerizirane i heksameri. Kada se s / c primjena heksamernih oblika apsorbira polako i vršna koncentracija hormona u krvi, slična onoj kod zdrave osobe nakon jela, nije moguće stvoriti. Prvi kratkodjelujući inzulinski analog, koji se apsorbira iz potkožnog tkiva 3 puta brže od humanog inzulina, bio je lispro inzulin. Inzulin lispro je derivat humanog inzulina dobiven zamjenom dva aminokiselinska ostatka u molekuli inzulina (lizin i prolin na položajima 28 i 29 B-lanca). Modifikacija molekule inzulina ometa stvaranje heksamera i osigurava brzu isporuku lijeka u krv. Gotovo odmah nakon injekcije u tkivima, molekule inzulina lispro u obliku heksamera brzo se disociraju u monomere i ulaze u krv. Drugi inzulinski analog - inzulin aspart - nastao je zamjenom prolina u položaju B28 s negativno nabijenom asparaginskom kiselinom. Kao inzulin lispro, nakon injekcije sc također brzo razgrađuje na monomere. Kod inzulina glulisina, zamjena humanog inzulina asparagina na položaju B3 za lizin i lizin na položaju B29 za glutaminsku kiselinu također doprinosi bržoj apsorpciji. Analozi inzulina ultrakratkog djelovanja mogu se primijeniti neposredno prije obroka ili nakon obroka.

Kratkodjelujući inzulini (također nazvani topljivi) su otopine u puferu s neutralnim pH vrijednostima (6.6-8.0). Namijenjeni su za potkožno, rjeđe - intramuskularno davanje. Ako je potrebno, primjenjuju se i intravenski. Imaju brz i relativno kratak hipoglikemijski učinak. Učinak nakon potkožnog ubrizgavanja javlja se nakon 15-20 min, maksimum doseže nakon 2 h; ukupno trajanje djelovanja je oko 6 sati, a uglavnom se koriste u bolnici tijekom utvrđivanja doze inzulina potrebne za pacijenta, a također i kada je potreban brz (hitan) učinak - u dijabetičkoj komi i prekomi. S / u uvodu T_1/2 čini 5 min, stoga se kod dijabetičke ketoacidotične komine inzulin daje u / u kapanju. Pripravci inzulina kratkog djelovanja također se koriste kao anabolička sredstva i propisuju se u pravilu u malim dozama (4-8 IU 1-2 puta dnevno).

Insulini srednjeg trajanja djelovanja su manje topljivi, polaganije se apsorbiraju iz potkožnog tkiva, zbog čega imaju duži učinak. Produženo djelovanje ovih lijekova postiže se prisutnošću posebnog prolongatora - protamina (izofan, protapan, bazal) ili cinka. Usporavanje apsorpcije inzulina u pripravcima koji sadrže suspenziju inzulinskog cinkovog spoja, zbog prisutnosti kristala cinka. NPH-inzulin (neutralni protamin Hagedorn ili izofan) je suspenzija koja se sastoji od inzulina i protamina (protamin je protein izoliran iz ribljeg mlijeka) u stehiometrijskom omjeru.

Dugodjelujući inzulini uključuju inzulin glargin - analog humanog inzulina, dobiven DNA rekombinantnom tehnologijom - prvi lijek za inzulin koji nema izražen vrh djelovanja. Inzulin glargin se dobiva pomoću dvije modifikacije u molekuli inzulina: zamjenom A-lanca (asparagina) s glicinom na položaju 21 i vezanjem dva argininska ostatka na C-kraj B-lanca. Lijek je bistra otopina s pH vrijednosti 4. Kiseli pH stabilizira heksamere inzulina i osigurava dugu i predvidljivu apsorpciju lijeka iz potkožnog tkiva. Međutim, zbog kiselog pH, inzulin glargin se ne može kombinirati s kratkodjelujućim inzulinima koji imaju neutralni pH. Jedna injekcija inzulina glargina osigurava 24-satnu kontrolu glikemije bez vrhunca. Većina pripravaka inzulina ima tzv. "Peak" djelovanja, zabilježeno kada koncentracija inzulina u krvi dosegne maksimum. Inzulin glargin nema izražen vrh, jer se oslobađa u krvotok relativno konstantnom brzinom.

Inzulinski pripravci s produljenim djelovanjem dostupni su u različitim doznim oblicima koji imaju hipoglikemijski učinak različitog trajanja (od 10 do 36 sati). Produženi učinak smanjuje broj dnevnih injekcija. Obično se proizvode u obliku suspenzija, koje se daju samo subkutano ili intramuskularno. U dijabetičkoj komi i predkomatoznim stanjima, produljeni lijekovi se ne koriste.

Kombinirani pripravci inzulina su suspenzije koje se sastoje od neutralnog topivog kratkodjelujućeg inzulina i inzulina-izofana (srednje trajanje djelovanja) u određenim omjerima. Ova kombinacija inzulina različitog trajanja djelovanja u jednom pripravku omogućuje pacijentu uštedu na dvije injekcije s odvojenom upotrebom lijekova.

Indikacije. Glavna indikacija za uporabu inzulina je šećerna bolest tipa 1, ali pod određenim uvjetima propisana je i za dijabetes melitus tipa 2, uklj. otpornost na oralne hipoglikemijske agense, s ozbiljnim popratnim bolestima, u pripremi za kirurške zahvate, dijabetičku komu, s dijabetesom u trudnica. Kratkodjelujući inzulini koriste se ne samo u šećernoj bolesti, već iu nekim drugim patološkim procesima, primjerice u općoj iscrpljenosti (kao anaboličko sredstvo), furunkulozi, tirotoksikozi, bolestima želuca (atoni, gastroptozi), kroničnom hepatitisu i primarnim oblicima ciroze jetre. kao i kod nekih mentalnih bolesti (primjena velikih doza inzulina - takozvana hipoglikemijska koma); ponekad se koristi kao komponenta "polarizirajućih" otopina koje se koriste za liječenje akutnog zatajenja srca.

Inzulin je glavni specifični tretman za dijabetes melitus. Liječenje šećerne bolesti provodi se prema posebno razvijenim shemama uz primjenu inzulinskih pripravaka različitog trajanja djelovanja. Izbor lijeka ovisi o težini i karakteristikama tijeka bolesti, općem stanju pacijenta i brzini početka i trajanju djelovanja lijeka koji smanjuje šećer.

Svi pripravci inzulina koriste se podložno obveznom pridržavanju prehrambenog režima uz ograničenje energetske vrijednosti hrane (od 1.700 do 3.000 kcal).

Prilikom određivanja doze inzulina, oni se rukovode razinom glukoze natašte i tijekom dana, kao i razinom glikozurije tijekom dana. Konačni odabir doze provodi se pod kontrolom smanjenja hiperglikemije, glikozurije, kao i općeg stanja pacijenta.

Kontraindikacije. Inzulin je kontraindiciran kod bolesti i stanja koja se javljaju s hipoglikemijom (na primjer, inzulinoma), u akutnim bolestima jetre, gušterače, bubrega, čira na želucu i dvanaesniku, dekompenziranim oštećenjima srca, u akutnoj koronarnoj insuficijenciji i nekim drugim bolestima.

Koristite tijekom trudnoće. Glavni lijek za liječenje šećerne bolesti tijekom trudnoće je terapija inzulinom, koja se provodi pod strogim nadzorom. U slučaju šećerne bolesti tipa 1, liječenje inzulinom se nastavlja. U slučaju šećerne bolesti tipa 2, oralni hipoglikemični lijekovi se poništavaju i provodi se dijetalna terapija.

Gestacijski diabetes mellitus (trudni dijabetes) je poremećaj metabolizma ugljikohidrata koji se prvi put pojavio tijekom trudnoće. Gestacijski diabetes mellitus povezan je s povećanim rizikom od perinatalne smrtnosti, učestalosti kongenitalnih malformacija, kao i rizika progresije dijabetesa 5-10 godina nakon poroda. Liječenje gestacijskog dijabetesa počinje s prehranom. Ako je dijetalna terapija nedjelotvorna, koristi se inzulin.

Za bolesnike s prethodno postojećim ili gestacijskim dijabetesom važno je održavati odgovarajuću regulaciju metaboličkih procesa tijekom cijele trudnoće. Potreba za inzulinom može se smanjiti u prvom tromjesečju trudnoće i povećati u drugom i trećem tromjesečju. Za vrijeme porođaja i odmah nakon njih, potreba za inzulinom može se dramatično smanjiti (povećava se rizik od hipoglikemije). U tim uvjetima je neophodno pažljivo praćenje glukoze u krvi.

Inzulin ne prodire u placentnu barijeru. Međutim, majčinska IgG protutijela na inzulin prolaze kroz posteljicu i vjerojatno uzrokuju hiperglikemiju u fetusu neutraliziranjem inzulina koji se izlučuje iz njega. S druge strane, nepoželjna disocijacija kompleksa inzulina i antitijela može dovesti do hiperinzulinemije i hipoglikemije kod fetusa ili novorođenčeta. Pokazalo se da je prijelaz iz goveđih / svinjskih inzulinskih pripravaka u monokomponentne pripravke popraćen smanjenjem titra antitijela. U tom smislu, tijekom trudnoće, preporuča se upotreba samo pripravaka humanog inzulina.

Analozi inzulina (kao i drugi novo razvijeni lijekovi) propisuju se oprezno tijekom trudnoće, iako nema pouzdanih dokaza o štetnim učincima. U skladu s opće prihvaćenim preporukama FDA (Uprave za hranu i lijekove), koje određuju mogućnost korištenja lijekova tijekom trudnoće, pripravci inzulina za učinak na fetus spadaju u kategoriju B (studija reprodukcije na životinjama nije otkrila štetne učinke na fetus te odgovarajuće i strogo kontrolirane studije kod trudnica). žene) ili u kategoriju C (studije o reprodukciji kod životinja otkrile su štetan učinak na fetus, a nisu provedene odgovarajuće i dobro kontrolirane studije kod trudnica, ali potencijalne koristi povezane s uporabom lijekova kod trudnica mogu opravdati njegovu uporabu, unatoč mogućem riziku). Dakle, inzulin lizpro spada u klasu B, a inzulin aspart i inzulin glargin - u klasu C.

Komplikacije inzulinske terapije. Hipoglikemija. Unošenje previsokih doza, kao i nedostatak unosa ugljikohidrata s hranom, može uzrokovati neželjeno hipoglikemijsko stanje, može se razviti hipoglikemijska koma s gubitkom svijesti, konvulzijama i depresijom srčane aktivnosti. Hipoglikemija se također može razviti zbog djelovanja dodatnih čimbenika koji povećavaju osjetljivost na inzulin (na primjer, adrenalna insuficijencija, hipopituitarizam) ili povećavaju apsorpciju glukoze u tkivu (vježbanje).

Rani simptomi hipoglikemije, koji su u velikoj mjeri povezani s aktivacijom simpatičkog živčanog sustava (adrenergički simptomi) uključuju tahikardiju, hladan znoj, tremor, aktivaciju parasimpatičkog sustava - tešku glad, mučninu i trnce u usnama i jeziku. Kod prvih znakova hipoglikemije treba poduzeti hitne mjere: pacijent treba piti slatki čaj ili pojesti nekoliko grudica šećera. U hipoglikemijskoj komi 40% -tna otopina glukoze u količini od 20-40 ml ili više ubrizgava se u venu sve dok pacijent ne napusti komatozno stanje (obično ne više od 100 ml). Hipoglikemija se također može ukloniti intramuskularnom ili subkutanom primjenom glukagona.

Povećanje tjelesne težine tijekom inzulinske terapije povezano je s uklanjanjem glukozurija, povećanjem stvarnog kalorijskog sadržaja hrane, povećanjem apetita i stimulacijom lipogeneze pod djelovanjem inzulina. Ako slijedite principe prehrane, to se može izbjeći.

Primjena suvremenih visoko pročišćenih hormonskih lijekova (osobito genetski modificiranih ljudskih inzulinskih pripravaka) relativno rijetko dovodi do razvoja inzulinske rezistencije i alergija, ali takvi slučajevi nisu isključeni. Razvoj akutne alergijske reakcije zahtijeva hitnu desenzibilizirajuću terapiju i zamjenu lijeka. Kada se razvije reakcija na pripravke inzulina goveda / svinje, treba ih zamijeniti pripravcima humanog inzulina. Lokalne i sistemske reakcije (pruritus, lokalni ili sistemski osip, stvaranje potkožnih nodula na mjestu ubrizgavanja) povezane su s neadekvatnim pročišćavanjem inzulina od nečistoća ili pomoću goveđeg ili svinjskog inzulina, koji se razlikuju u aminokiselinskoj sekvenci od čovjeka.

Najčešće alergijske reakcije su antitijela na koži, IgE. Povremeno se uočavaju sistemske alergijske reakcije, kao i inzulinska rezistencija posredovana IgG protutijelima.

Zamagljen vid Prolazni poremećaji loma oka javljaju se na samom početku inzulinske terapije i nestaju sami za 2-3 tjedna.

Oteklina. U prvim tjednima terapije dolazi do prolaznog edema nogu zbog zadržavanja tekućine, tzv. oticanje inzulina.

Lokalne reakcije uključuju lipodistrofiju na mjestu ponovljenih injekcija (rijetka komplikacija). Izdvojite lipoatrofiju (nestanak naslaga potkožnog masnog tkiva) i lipohipertrofiju (povećano odlaganje potkožnog masnog tkiva). Ove dvije države imaju različitu prirodu. Lipoatrofija - imunološka reakcija, uglavnom zbog primjene slabo pročišćenih pripravaka inzulina životinjskog podrijetla, sada praktički nije pronađena. Lipohipertrofija se razvija uz primjenu visoko pročišćenih pripravaka humanog inzulina i može se pojaviti ako je tehnika ubrizgavanja poremećena (hladna priprema, alkohol dobiva ispod kože), a također i zbog anaboličkog lokalnog djelovanja samog preparata. Lipohipertrofija stvara kozmetički defekt koji je problem za pacijente. Osim toga, zbog ovog nedostatka, apsorpcija lijeka je umanjena. Da bi se spriječio razvoj lipohipertrofije, preporuča se stalno mijenjati mjesta ubrizgavanja unutar istog područja, ostavljajući barem 1 cm između dvaju punkcija.

Mogu postojati lokalne reakcije kao što je bol na mjestu primjene.

Interakcija. Pripravci inzulina mogu se međusobno kombinirati. Mnogi lijekovi mogu uzrokovati hipo- ili hiperglikemiju, ili promijeniti reakciju pacijenta sa šećernom bolešću na liječenje. Trebate razmotriti interakciju, moguće uz istovremenu uporabu inzulina s drugim lijekovima. Alfa-blokatori i beta-adrenomimetiki povećavaju izlučivanje endogenog inzulina i povećavaju učinak lijeka. Hipoglikemijski učinak inzulina pojačan je oralnim hipoglikemijskim agensima, salicilatima, MAO inhibitorima (uključujući furazolidon, prokarbazin, selegilin), ACE inhibitorima, bromokriptinom, oktreotidom, sulfanilamidima, anaboličkim steroidima (posebno oksandrolonom, metandienonom), te anaboličkim steroidima, anaboličkim steroidima glukagona, što dovodi do hipoglikemije, posebno u slučaju rezistencije na inzulin, možda ćete trebati smanjiti dozu inzulina), analoze somatostatina, gvanetidina, dizo piramide, klofibrat, ketokonazol, preparati litija, mebendazol, pentamidin, piridoksin, propoksifen, fenilbutazon, fluoksetin, teofilin, fenfluramin, preparati litija, pripravci kalcija, tetraciklini. Klorokin, kinidin, kinin smanjuju razgradnju inzulina i mogu povećati koncentraciju inzulina u krvi i povećati rizik od hipoglikemije.

Inhibitori karboanhidraze (posebno acetazolamid), stimuliranjem β-stanica gušterače, potiču oslobađanje inzulina i povećavaju osjetljivost receptora i tkiva na inzulin; iako istovremena uporaba ovih lijekova s ​​inzulinom može povećati hipoglikemijski učinak, učinak može biti nepredvidljiv.

Brojni lijekovi uzrokuju hiperglikemiju kod zdravih ljudi i pogoršavaju tijek bolesti u bolesnika s dijabetesom. Hipoglikemijski učinak inzulina je oslabljen: antiretrovirusni lijekovi, asparaginaza, oralni hormonalni kontraceptivi, glukokortikoidi, diuretici (tiazidi, etakrinska kiselina), antagonisti heparina, H₂-receptori, sulfinpirazon, triciklički antidepresivi, dobutamin, izoniazid, kalcitonin, niacin, simpatomimetici, danazol, klonidin, BKK, diazoksid, morfin, fenitoin, somatotropin, tiroidni hormoni, derivati ​​fenotiazina, nikotin, etanol, derivati ​​fenotiazina, nikotin, etanolni

Glukokortikoidi i epinefrin imaju suprotan učinak na inzulin na perifernim tkivima. Prema tome, dugotrajno davanje sistemskih glukokortikoida može uzrokovati hiperglikemiju, do i uključujući dijabetes melitus (steroidni dijabetes), koji se može pojaviti u oko 14% pacijenata koji uzimaju sistemske kortikosteroide nekoliko tjedana ili s dugotrajnom primjenom topikalnih kortikosteroida. Neki lijekovi izravno inhibiraju izlučivanje inzulina (fenitoin, klonidin, diltiazem) ili smanjenjem rezervi kalija (diuretici). Hormoni štitnjače ubrzavaju metabolizam inzulina.

Najznačajniji i često utječu na djelovanje beta-blokatora inzulina, oralnih hipoglikemijskih sredstava, glukokortikoida, etanola, salicilata.

Etanol inhibira glukoneogenezu u jetri. Taj se učinak primjećuje kod svih ljudi. U tom smislu, treba imati na umu da zlouporaba alkoholnih pića u pozadini terapije inzulinom može dovesti do razvoja teškog hipoglikemijskog stanja. Male količine alkohola uzete s hranom obično ne uzrokuju probleme.

Beta-blokatori mogu inhibirati izlučivanje inzulina, promijeniti metabolizam ugljikohidrata i povećati perifernu otpornost na inzulin, što dovodi do hiperglikemije. Međutim, oni također mogu inhibirati učinak kateholamina na glukoneogenezu i glikogenolizu, što je povezano s rizikom od teških hipoglikemijskih reakcija kod dijabetičara. Štoviše, bilo koji od beta-adrenergičkih blokatora može prikriti adrenergijske simptome uzrokovane smanjenjem razine glukoze u krvi (uključujući tremor, palpitacije), čime se narušava pacijentovo pravovremeno prepoznavanje hipoglikemije. Selektivna beta₁-adrenergički blokatori (uključujući acebutolol, atenolol, betaksolol, bisoprolol, metoprolol) pokazuju ove učinke u manjoj mjeri.

NSAID i visoke doze salicilata inhibiraju sintezu prostaglandina E (koji inhibira izlučivanje endogenog inzulina) i na taj način povećavaju bazalnu sekreciju inzulina, povećavaju osjetljivost β-stanica gušterače na glukozu; hipoglikemijski učinak s istovremenom primjenom može zahtijevati prilagodbu doze NSAR-a ili salicilata i / ili inzulina, posebno s dugotrajnim dijeljenjem.

Trenutno se proizvodi značajan broj pripravaka inzulina, uklj. dobiveni iz gušterače životinja i sintetizirani genetskim inženjeringom. Preparati odabrani za inzulinsku terapiju su genetski modificirani visoko pročišćeni humani inzulini s minimalnom antigenošću (imunogena aktivnost), kao i analozi humanog inzulina.

Pripravci inzulina proizvode se u staklenim bočicama, hermetički zatvorene gumenim čepovima s aluminijskim tijelom, u posebnim tzv. inzulinske štrcaljke ili brizgalice. Pri uporabi olovaka za brizganje pripravci se nalaze u posebnim spremnicima s bočicama (penfill).

Razvijaju se intranazalni oblici inzulina i inzulinskih pripravaka za oralnu primjenu. Kod kombinacije inzulina s deterdžentom i primjene u obliku aerosola na nazalnoj sluznici, efektivna razina u plazmi se postiže tako brzo kao kod IV bolus davanja. Intranazalni i oralni pripravci inzulina razvijaju se ili prolaze kroz klinička ispitivanja.