Određivanje glukoze metodom glukoza oksidaze

Analize

Određivanje koncentracije glukoze u krvi jedna je od najčešće provedenih biokemijskih studija u laboratorijima.

Metoda glukoza-oksidaze za određivanje glukoze u krvi i urinu temelji se na reakciji oksidacije glukoze u prisutnosti enzima glukoza-oksidaze s nastankom vodikovog peroksida, koji zauzvrat u prisutnosti peroksidaze oksidira ortotolidin u obliku obojenih proizvoda; • Koncentracija glukoze je obećana količinom obojenih proizvoda.

Budući da je cilj metode glukoza oksidaze utvrđivanje glukoze, a ne svih vrsta šećera, ona se koristi u diferencijalnoj dijagnostici sljedećih bolesti:

Princip metode glukoze oksidaze za određivanje glukoze

Glukoza u prisutnosti enzima glukoza oksidaze oksidira atmosferski kisik kako bi nastala vodikov peroksid tijekom reakcije. Vodikov peroksid u prisutnosti enzima peroksidaze oksidira ortotoluidin u obliku obojenog spoja, čiji je intenzitet boje proporcionalan sadržaju glukoze. Ova metoda omogućuje određivanje razine glukoze u krvnoj plazmi, serumu i cerebrospinalnoj tekućini.

Normalna razina glukoze u krvi, mmol / l

- u plazmi, u natsheartse

novorođenčad - 1,7 - 4,2
djeca od 6 tjedana do 15 godina - 3,3 - 5,4
odrasli (muškarci, žene) - 3,9 - 5,6

- u serumu, u natsheartse

novorođenčad - 2,6 - 4,2
djeca od 6 tjedana do 2 godine - 3,3 - 5,4
odrasli (muškarci, žene) - 3,9 - 5,6

Potrebni reagensi za određivanje glukoze metodom glukoza oksidaze

1. Natrijev klorid 9 grama / l (izotonična otopina): pripremljen otapanjem 0,9 g NaCl u 100 ml vode.

2. Cink sulfat, 50 g / l: 5 g cinkovog sulfata (ZnS04) se otopi u vodi, a volumen dovede do 100 ml.

3. Natrijev hidroksid, 0,3 mol / l: pripremljen otapanjem 1,2 g NaOH u 100 ml vode, koncentracija se provjerava titracijom (trebala bi biti 0,3 n).

4. Ortotoluidin, 1% otopina: 1 g lijeka se otopi u 100 ml apsolutnog alkohola. Otopina se može čuvati u hladnjaku u tikvici s staklenim čepom nekoliko mjeseci. Komercijalno dostupan produkt može se pročistiti prekristalizacijom, za koju se otopi u apsolutnom alkoholu, doda se voda i istaloženi kristali se odsišu na filteru, zatim osuše preko kalcijevog klorida.

5. Otopina acetatnog pufera pH 4,8: pomiješati 4 dijela 0,25 n octene kiseline (provjeriti titracijom) i 6 dijelova 0,25 n natrijevog acetata (sadrži 34 g CH3COONa X ZN2O u 1 litri).

6. Glukoza oksidaza je suhi preparat s aktivnošću od 3000 jedinica / mg ili više.

7. Peroksidaza hrena. 1 mg se otopi u 5 ml acetatnog pufera, može se čuvati u hladnjaku nekoliko dana.

8. Radni reagens: otopiti 2 mg glukoze oksidaze i 1 mg peroksidaze u 80 ml acetatnog pufera, dodati 1 ml 1% otopine ortotoluidina, promiješati i pustiti otopinu na 100 ml. Radni reagens mora biti proziran, bezbojan ili imati slabu zelenu nijansu, u kojem slučaju je stabilan kada se čuva na hladnom. Ako je boja intenzivna ili nakon nekoliko sati nakon pripreme, talog počinje padati, što znači da ortotoluidin nije dovoljno čist i treba ga rekristalizirati.

9. Umjeravanje otopina glukoze. Glukoza se prethodno suši na 37 ° C i pohranjuje u eksikator. Najprije pripremite bazičnu otopinu s koncentracijom od 50 mmol / l, za koju se otopi 180 mg tvari u 20 ml zasićene otopine (približno 0,3%) benzojeve kiseline. Iz te otopine pripremite radne otopine za kalibraciju koje sadrže 3; 6; 9; 12; 15; 18 i 21 mmol / l, za koje uzimaju 0,6; 1,2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 i 4,2 ml bazične otopine i dovede se zasićena otopina benzojeve kiseline do volumena od 10 ml. Ove otopine sadrže glukozu u istim koncentracijama kao što se događa u krvi, što olakšava izračunavanje tijekom kalibracije.

Napredak određivanja glukoze metodom glukoza oksidaze

U epruvete za centrifugiranje dodajte 1,1 ml otopine natrijeva klorida, 0,4 ml otopine cinkovog sulfata i 0,4 ml 0,3 n otopine NaOH, pomiješajte; u isto vrijeme, formira se vrlo tanki gel cinkovog hidroksida, u njega se oslobodi 0,1 ml krvi ili otopine za kalibriranje, ponovno miješa i centrifugira nakon 10 minuta pri brzini od 3000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta.

U 1 ml supernatanta dodajte 3 ml radnog reagensa i lagano promiješajte.

Postupno se počinje razvijati boja, koja pri normalnoj sobnoj temperaturi doseže maksimum za 13-15 minuta, a zatim se postupno smanjuje. Fotometrijski uvijek nakon istog vremenskog perioda nakon dodavanja radnog reagensa u kivete s optičkom dužinom od 1 centimetra s crvenim svjetlosnim filtrom (valna duljina 625 nm) protiv praznog iskustva, koje se postavlja istodobno s radnim uzorcima, ali umjesto krvi uzimati fiziološki natrijev klorid.

Pri pripremi kalibracijskog grafikona umjesto uzoraka krvi uzima se 0,1 ml odgovarajuće otopine za umjeravanje.

Izračunavanje glukoze može se provesti u skladu s pravilom proporcija ili kalibrirajućim rasporedom, kako bi se odredila koncentracija glukoze (mmol / l) na jednoj osi, a vrijednost ekstinkcije na drugu.

Napomene o metodi određivanja glukoze oksidaznom metodom

1. Prvo možete ispustiti krv iz pipete u izotoničnu otopinu natrijeva klorida, a zatim dodati otopine cinkovog sulfata i NaOH.

2. Sustavnim radom nema potrebe stalno graditi raspored kalibriranja za sve točke, dovoljno je obraditi prazan uzorak i 2-3 točke u rasponu od 3-9 mmol / l dnevno, te izraditi punu kalibracijsku shemu samo kada mijenjamo reagense ili podešavamo postupak.

Metoda određivanja glukoze glukoznom oksidazom

Metoda glukoza oksidaze koristi se za određivanje koncentracije glukoze isključivo u različitim tjelesnim tekućinama. Prednost ovog testa je njegova točnost. Dijagnostika, za razliku od brzih metoda, omogućuje otkrivanje količine čiste glukoze, bez fruktoze i drugih šećera. Načelo ove reakcije je bojanje otopine koja nastaje kao posljedica interakcije oksidirajućih sredstava sa specifičnim bojama. Evaluacija rezultata istraživanja provodi se metodom kolorimetrije i usporedbom sa standardnim otopinama.

Kada se propisuje metoda glukozne oksidaze?

Ovaj se test koristi za otkrivanje narušene tolerancije šećera i razvoj pred-dijabetesa, kao i na visinu bolesti. No, analiza se rijetko koristi u takve svrhe, zbog visoke cijene i dugog čekanja na rezultat. Određivanje glukoze u krvi i urinu najčešće se koristi u diferencijalnoj dijagnostici bolesti kao što su:

sindrom nepodnošenja laktoze;
netolerancija na fruktozu;
oslobađanje fruktoze s tjelesnim tekućinama;
povećana koncentracija pentoze u urinu.

Nesumnjiva prednost testa glukoza oksidaze je njegova točnost.

Što je osnova ove metode?

Postoje različite metode za određivanje koncentracije glukoze u krvi, ali glukoza oksidaza je najpreciznija. Zaključak je da interakcija šećera s kisikom u zraku oksidira reagens. Vodikov peroksid se oslobađa u otopinu. Ova supstanca stupa u interakciju s ortotoluidinom, formirajući obojeni spoj. Za ponašanje ove reakcije potrebno je prisustvo posebnih enzima. Glukoza oksidaza mora biti prisutna u oksidacijskoj reakciji, a peroksidaza u bojanju tekućine. Intenzitet boje otopine ovisit će o sadržaju glukoze i biti najintenzivniji s visokim sadržajem.

Suština metode glukoza oksidaze za određivanje glukoze

Evaluacija rezultata se vrši kvantitativnom metodom fotometrije u istom vremenskom intervalu. Budite sigurni da koristite kalibracijsku otopinu koja sadrži određenu navedenu količinu šećera i, počevši od nje, možete prosuditi koncentraciju glukoze u tjelesnim tekućinama, često u krvi.

Kako se vrši analiza?

Materijal se uzima od pacijenta na prazan želudac. Za test koristite vensku krv u količini od 5 ml. Uoči dijagnoze, pacijentu se pokazuje stroga dijeta. To će omogućiti procjenu pouzdanosti rezultata i isključiti moguće pogreške u analizi. 2 dana prije povlačenja krvi, pacijent mora odustati od loših navika pijenja i pušenja. Također je potrebno ograničiti unos pretjerano slatkih jela i, ako je moguće, izbjegavati stresne situacije.

Najčešće se ova metoda određivanja koncentracije glukoze provodi metodom centrifugiranja, koja se koristi za odvajanje oblikovanih elemenata. Količina šećera određena je u plazmi. Kada mu se dodaju svi potrebni reagensi, boja se promatra nakon 20 minuta ako se ispitivanje provodi na sobnoj temperaturi. Izračunavanje razine glukoze provodi se prema kalibrirajućem rasporedu ili primjenom pravila dijelova.

Reagensi za istraživanje

Za određivanje šećera je najpogodnije koristiti brze metode za određivanje glukoze u krvi. To je zbog jednostavnosti korištenja i brzih rezultata. Osim toga, pacijent ne mora ići u laboratorij ili bolnicu. Ali za razliku od testa glukoza-oksidaze, takva je dijagnoza nepouzdana. Budući da ne razlikuje glukozu od drugih šećera i određuje njihovu koncentraciju zajedno.

Osnova reakcije glukoza-oksidaze je 9% -tna otopina natrijevog klorida i 50% -tni cinkov sulfat. Dodaju se u fazi centrifugiranja krvi. Osim toga, upotrijebite pufer otopinu s octenom kiselinom i natrijevim acetatom. Metoda titracije određuje pH na 4,8. Nakon toga se dodaje glukoza oksidaza, koja uzrokuje vodikov peroksid i peroksidazu, koja je uključena u bojenje otopine do željene koncentracije da se dobije točan rezultat.

Standardi tijekom analize

Količina šećera mjeri se u posebnim jedinicama - milimolima po litri otopine.

Krvni testovi na glukoznu oksidazu moraju se provesti na prazan želudac, a za to se koristi plazma ili serum. Stopa njenog broja za odrasle za žene i muškarce je 3,3-5,5. Za djecu mlađu od 15 godina ta je brojka nešto niža i varira između 3,2 i 5,3. Kod novorođenčadi glukoza u krvi je 1,7–4,2. Povećanje učinka uočava se s razvojem bolesnika sa šećernom bolešću ili kršenjem tolerancije glukoze. Ovo stanje je predijabetes, a ako se ne liječi na vrijeme, uskoro će dovesti do razvoja te teške patologije.

RADNI BROJ 1. KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE GLUKOZE U KRVI. ENZIMATSKA (GLUKOSOKSIDALNA) METODA

OBRAZLOŽENJE ZA IZVRŠENJE RADA. Određivanje glukoze u punoj krvi ili plazmi vrši se kod svakog pacijenta radi procjene stanja metabolizma ugljikohidrata i dijagnosticiranja patologije (hiperglikemija, hipoglikemija). Za određivanje sadržaja glukoze u krvi koristi se enzimska metoda koja se temelji na oksidaciji glukoze oksidaze u glukonskoj kiselini u prisutnosti kisika. Metoda je vrlo specifična za određivanje D-glukoze u prisustvu drugih reducirajućih tvari sadržanih u ekstraktima tkiva i biološkim tekućinama.

NAČELO METODE. Glukoza oksidaza je kompleksni enzim koji sadrži FAD kao protetsku skupinu. Kada se glukoza oksidira glukoznom oksidazom, dva atoma vodika odvajaju se od prvog ugljikovog atoma u molekuli glukoze. Nadalje, ova dva atoma vodika se prenose u FAD, formira se FADH₂. Potonji prenosi atome vodika na molekulski kisik i tvori H₂oh₂. Zatim H₂oh₂ odvaja se enzimom peroksidaze u vodu i atomski kisik, koji oksidira kromogen (boja), koji se tijekom oksidacije oboji.

Metoda glukoza oksidaze

Danas se metode koje se temelje na uporabi enzima glukoza oksidaze najčešće koriste. Metoda se temelji na sljedećoj reakciji:

Glukoza oksidaza katalizira prijenos dva atoma vodika s prvog ugljikovog atoma glukoze na kisik otopljen u tekućem reagensu. Tijekom reakcije nastaje vodikov peroksid u ekvimolarnim količinama. tj koncentracija nastalog vodikovog peroksida je točno jednaka određenoj koncentraciji glukoze. Prema tome, primjena reakcije glukoze oksidaze pretvorila je problem određivanja koncentracije glukoze u problem određivanja koncentracije vodikovog peroksida, koji je, kao što će biti prikazano dolje, mnogo jednostavniji od prvog. I ovdje postoji nekoliko metoda koje se danas široko koriste u laboratorijskoj praksi (vidi dijagram).

Među navedenim metodama registracije, najčešće korištena fotometrijska biokemijska metoda, u kojoj se molekule vodikovog peroksida pod djelovanjem enzima peroksidaze razdvajaju na formiranje aktivnog kisikovog oblika - superoksidnog anionskog radikala - O₂ -, što zauzvrat oksidira kromogen, što dovodi do značajne promjene u apsorpcijskom spektru kromogena.

Velika popularnost ove metode za određivanje glukoze je zbog njene visoke specifičnosti i lakoće provedbe. Metoda se može primijeniti pomoću konvencionalnog fotometra, kao i pomoću automatskih biokemijskih autoanalizatora.

Metoda glukozne oksidaze danas je prepoznata kao jedna od najtočnijih kvantitativnih metoda za određivanje glukoze. Kao biološki materijal koristi se kao serum i cijela krv. Pri radu s potonjim treba uzeti u obzir činjenicu da kada se uzima kapilarna krv, udio seruma (plazme) ovisi o vrijednosti hematokrita, što može negativno utjecati na točnost rezultata. Stoga, kada se određuje glukoza gore opisanom metodom, poželjno je koristiti pacijentov serum.

Uz fotometrijsku metodu krajnje točke, prije nekoliko godina pojavili su se kompleti u kojima je provedena kinetička fotometrijska metoda. Suština metode je da pri određenom omjeru aktivnosti glukozne oksidaze i peroksidaze brzina stvaranja obojenog spoja neko vrijeme nakon dodavanja uzorka u radnu otopinu bude proporcionalna koncentraciji glukoze u uzorku. Prednost ove metode je u tome što rezultat ne ovisi o prisutnosti drugih spojeva u uzorku, jer je apsorpcija potonjeg stabilna tijekom vremena. Ova metoda zahtijeva uporabu kinetičkog fotometra, poluautomatskih analizatora ili automatskih biokemijskih analizatora. Mjerenje koncentracije glukoze iz pune krvi praktično se provodi pomoću instrumenata čije se djelovanje temelji na amperometrijskom principu mjerenja, koristeći posebne enzimske senzore. Vodikov peroksid je izuzetno nestabilan kemijski spoj i može poslužiti kao izvor nabijenih čestica. To je ono što se koristi u enzimskim senzorima membranskog tipa ili u elektrokemijskim elementima prijenosnih glukometara.

U zaključku treba spomenuti nedostatke metode glukoza-oksidaze. Nastali vodikov peroksid i superoksidni anionski radikali mogu oksidirati ne samo kromogen, već i druge tvari prisutne u biološkoj tekućini: askorbinsku kiselinu, mokraćnu kiselinu, bilirubin. Istodobno se smanjuje udio peroksida, koji sudjeluje u oksidaciji kromogena, što dovodi do podcjenjivanja rezultata glukoze. Ova metoda je u pravilu linearna, do 20-30 mmol / l glukoze.

Kvantitativno određivanje glukoze u krvi metodom glukoza oksidaze

Načelo metode. Metoda se temelji na specifičnosti djelovanja enzima glukoza oksidaze. Ovaj enzim oksidira glukozu u prisutnosti molekularnog kisika kako bi nastao glukonolakton, koji se spontano hidrolizira u glukonsku kiselinu. Glukoza oksidaza oksidira glukozu u obliku vodikovog peroksida (H₂oh₂), koji pod djelovanjem peroksidaze reagira s 4-aminoantipirinom i fenolom. Rezultat je spoj boje ružičaste boje, čija je optička gustoća na 510 nm proporcionalna koncentraciji glukoze u uzorku.

2 N₂oh₂ + 4-aminoantipirin + fenol → kinon imin + 4H₂oh

oprema: KFK, centrifuge, termostati, stativi, epruvete, pipete, biološki materijal, reagensi sadržani u radnoj otopini.

ispitni uzorak, ml

standardni uzorak, ml

jedno ispitivanje (N₂O), ml

Kalibracijska otopina glukoze (standardna)

Epruvete se 15 minuta inkubiraju u termostatu na 37 ° C, a zatim kolorimetriraju sa zelenim filtrom u zelenom filteru u kivetama debljine sloja od 5 mm nasuprot slijepe probe (H).₂O). Ružičasta boja je stabilna 1 sat nakon inkubacije.

računanje sadržaj glukoze proizveden formulom:

C = x C standard, gdje

C je sadržaj glukoze u eksperimentalnom uzorku, mol / l;

Eop je optička gustoća uzorka;

Est je optička gustoća kalibracijskog uzorka;

S standard - sadržaj u kalibracijskoj otopini, mol / l.

Normalne vrijednosti:  novorođenčad - 2,8-4,4 mmol / l

 djeca - 3,9 -5,8 mmol / l

 odrasle osobe - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hipoglikemija (HGH). Povećanje glukoze u krvi je zbog mnogih razloga, prema kojima postoje dvije skupine hiperglikemije.

1. Insular - povezan s nedovoljnim sadržajem inzulina u tijelu ili zbog nedjelotvornosti njegovog djelovanja.

2. Extrainsular (extrainsular) - ne ovisi o učinku inzulina.

Sljedeći procesi su najznačajniji u formiranju HGH: pojačano razlaganje glikogena; povećana neoglukogeneza; inhibicija sinteze glikogena; smanjenje iskorištenja glukoze u tkivima pod utjecajem hormonskih antagonista inzulina: somatotropina, glukokortikoida, tiroksina, tirotropina.

Alimentarna hiperglikemija je zabilježena kod pretjerane opskrbe glukoze u krvi (na primjer, hiperglikemija pod opterećenjem šećerom). "Hepatična" hiperglikemija javlja se kod difuznih lezija jetre.

Trajna i teška hiperglikemija najčešće prati dijabetes melitus. Uobičajeno je izolirati inzulin ovisni dijabetes melitus i dijabetes mellitus neovisan o inzulinu, odnosno, dijabetes melitus tipa I i dijabetes melitus tipa II. Stvaranje dijabetes melitusa tipa I povezano je prvenstveno s poremećenom sintezom i izmjenom inzulina.

Druga skupina hiperglikemije prvenstveno je povezana s hiperfunkcijom endokrinih žlijezda koje proizvode hormone - antagoniste inzulina. Primjećuje se kod bolesti kao što su sindrom i Cushingova bolest, akromegalija, tirotoksikoza, feokromocitom, glukogenom. Razina glukoze u krvi također se povećava u određenim bolestima jetre (osobito u 10-30% bolesnika s cirozom jetre), hemokromatozom (pigmentirana ciroza jetre, brončani dijabetes).

Hipoglikemija (HGP) - smanjenje glukoze u krvi - najčešće povezano s apsolutnim ili relativnim povećanjem razine inzulina u krvi. Vnepankreaticheskim hipoglikemija promatrati kao rezultat neravnoteže između opsegu procesi glikogenolize i glukoneogeneze u jetri, tijekom akutnog i kroničnog hepatitisa, ciroze, akutne i subakutne bolesti jetre, intoksikacija alkoholom, trovanja arsen, fosfor, tijekom dužeg mehaničke žutice, kongestivno jetre, primarnim ili metastatskim rakom jetre, Smanjenje koncentracije glukoze u krvi često se primjećuje kod pacijenata oboljelih od raka jednjaka i drugih malignih tumora ekstrapankreatičke lokalizacije (fibroma, fibrosarkoma, neuroma), kao i neukrotivog povraćanja, anoreksije, dijabetesa u jetri, uremije, obilne laktacije i glukozurije u trudnica.

Hipoglikemija može biti središnjeg porijekla zbog mentalne traume, encefalitisa, subarahnoidnog krvarenja, tumora mozga.

1. Nasljedni poremećaji probave ugljikohidrata.

2. Koje su vam vrste hiperglukoze poznate?

3. Koji su uzroci patološke hiperglukozemije?

4. Koji je uzrok dijabetesa melitusa ovisnog o inzulinu?

5. Koji su biokemijski uzroci nasljednih bolesti: a) glikogenoza? b) aglikogenoza? c) fruktozemija? d) galaktosemija?

6. Koje su biokemijske promjene u metabolizmu ugljikohidrata tijekom gladovanja?

7. Načelo metode određivanja tolerancije glukoze.

Metode glukozoksidaze i heksokinaze za određivanje serumske glukoze u krvi

Točna dijagnoza, propisivanje liječenja zahtijeva niz laboratorijskih testova.

Metoda određivanja glukoze u serumu je najvažnije sredstvo za otkrivanje hiper- i hipoglikemije u bolesnika sa šećernom bolešću.

Metoda omogućuje prilagodbu podataka o metaboličkim poremećajima u medicinskoj terapiji. Dijagnostičke razine glukoze također se mogu odrediti u punoj krvi i plazmi.

Metode za određivanje glukoze u krvi

Mnogo se razvila metoda za određivanje količine glukoze u krvi.

Neke od njih (reduktometrijske, kolorimetrijske) praktički se ne koriste zbog visoke toksičnosti i niske točnosti rezultata.

Najčešće korištene enzimske studije. Metoda glukoza-oksidaze je metoda reakcije boje koja se događa kada se ugljikohidrati zagrijavaju. Heksokinaza određuje aktivnost krvi na heksokinazi.

Metoda glukoza oksidaze

Metoda glukoza-oksidaze za određivanje glukoze u krvi temelji se na njegovoj oksidacijskoj reakciji pod utjecajem enzima. To tvori vodikov peroksid, mrlje tvari Chromogen, čija koncentracija određuje količinu glukoze.

Metoda glukoza oksidaze koristi se za:

nasljedna netolerancija na fruktozu;
pentosuria;
intolerancija na laktulozu.

Nedostatak studije je da je vodikov peroksid sposoban oksidirati i kromogen i askorbinsku, mokraćnu kiselinu i bilirubin prisutne u krvi. Izračunajte količinu fotometrijske metode glukoze, intenzitet bojenja se uspoređuje s kalibracijskim grafom.

U laboratorijskim uvjetima može se odrediti razina tvari:

u venskoj krvi. Koriste se automatski analizatori;
u kapilarnoj krvi. Ograda se izvodi iz prsta.

Elektrokemijska metoda se sastoji od korištenja elektroda koje sadrže glukozu oksidazu. Određena je količina nastalog vodikovog peroksida, ili preostala količina kisika potrošenog tijekom procesa oksidacije.

Metoda heksokinaze

Tvar je najvažniji enzim metabolizma glukoze, koji ograničava brzinu procesa u stanicama.

U laboratorijskim uvjetima, pod djelovanjem heksokinaze, glukoza se fosforilira adenozin trifosfatom.

Kao rezultat reakcije nastaju organske molekule čija se količina određuje razinom apsorpcije svjetla u ultraljubičastoj zoni. Prebrza pozitivna reakcija heksokinaze također može biti znak pojave malignih tumora.

Priprema za analizu

Testovi glukoze u krvnom serumu propisani su za:

Prije analize potrebno je slijediti niz uvjeta kako bi rezultati bili što pouzdaniji:

istraživanje se provodi na prazan želudac. Materijal uzet ujutro;
nekoliko dana prije postavljanja dijagnoze potrebno je izbjegavati teške fizičke napore, stres;
U dnevnoj prehrani pacijenta mora biti najmanje 150 grama ugljikohidrata. Uz nedostatak, razina glukoze će se povećati, i ona će polako pasti, što narušava analizu podataka;
dan prije dijagnoze ne može pušiti i piti alkoholna pića;
nemoguće je provesti istraživanja nakon teških operacija, porođaja, uz prisutnost upala. Kontraindicirano u analizi ciroze jetre, pogoršanju bolesti želuca, tumorskim procesima;
Nekoliko dana prije istraživanja ne treba prolaziti fizioterapeutske postupke, uzimati oralne kontraceptive, diuretske lijekove, psihotropne lijekove, kofein.

Analiza može dati lažno pozitivan rezultat u hipokalemiji i endokrinim bolestima (Cushingov sindrom, tirotoksikoza).

Norme glukoze u krvnom serumu po starosti

Normalni pokazatelji ovise o dobi:

krv iz pupkovine može sadržavati od 2,5 do 5,3 mmol / l;
kod nedonoščadi - od 1,1 do 3 mmol / l;
djeca prvog dana života - od 2,22 do 3,33;
u dobi od 2,7 do 4,4;
u djece starije od 6 godina - od 3,3 do 5,5 mmol / l;
kod odraslih do 60 godina - od 4,4 do 6,3;
u starijih osoba - od 4,6 do 6,1 mmol / l.

Hipoglikemiji kod odraslih dijagnosticira se vrijednost glukoze manja od 3,3 mmol / l, a hiperglikemija - više od 6,1 mmol / l.

Metoda glukoza-oksidaze za određivanje glukoze u plazmi

Drago nam je što vas možemo pozdraviti na stranici www.unimedao.ru!

Hvala vam što ste odgovorili na naše pitanje.

2009/11/19

Dr. Gerasimenko V.A., Kurilyak O.A.

Iz arhive novina "Vijesti A / O Unimed"

Određivanje koncentracije glukoze u krvi jedno je od najčešće provedenih biokemijskih ispitivanja u QDL. Razlog za iznimnu popularnost testa povezan je s visokom učestalošću dijabetesa. Ovaj se test provodi u bolničkim i ambulantnim bolnicama. Pacijenti s dijabetesom prisiljeni su ispitati razinu glukoze u krvi kod kuće, jer bez tih informacija teško im je prilagoditi prehranu, vježbanje, upotrebu inzulina i drugih antidijabetičkih lijekova. Iznimna važnost testa i velika količina provedenih istraživanja potaknuli su programere na stvaranje različitih vrsta uređaja i metoda za određivanje koncentracije glukoze u krvi.

Trenutno postoje mnoge metode za određivanje glukoze. Mogu se klasificirati na sljedeći način.

Metode za određivanje glukoze u serumu

- fotometrijska krajnja točka

- reflektirajuća fotometrija - suha kemija

Prve dvije metode su iznimno nezgodne, toksične i imaju nisku točnost, pa se nećemo zadržavati na njima.

Metoda glukoza oksidaze

Danas se metode koje se temelje na uporabi enzima glukoza oksidaze najčešće koriste. Metoda se temelji na sljedećoj reakciji:

Na sl. Slike 1 i 2 prikazuju spektre radne otopine prije i nakon dodavanja standardne otopine glukoze. Maksimalna apsorpcija reakcijske smjese - (reagens + glukoza) je u području od 500 nm. Prema tome, promjena optičke gustoće konačne reakcije na valnoj duljini 480-520 nm proporcionalna je koncentraciji glukoze sadržane u uzorku.

Velika popularnost ove metode za određivanje glukoze je zbog njene visoke specifičnosti i lakoće provedbe. Metoda se može primijeniti pomoću konvencionalnog fotometra (bolje od specijaliziranog biokemijskog fotometra kao što je Mikrolab 540), ili pomoću automatskih biokemijskih autoanalizatora.

Uz fotometrijsku metodu krajnje točke, prije nekoliko godina pojavili su se kompleti u kojima je provedena kinetička fotometrijska metoda. Suština metode je da pri određenom omjeru aktivnosti glukozne oksidaze i peroksidaze brzina stvaranja obojenog spoja neko vrijeme nakon dodavanja uzorka u radnu otopinu bude proporcionalna koncentraciji glukoze u uzorku. Prednost ove metode je u tome što rezultat ne ovisi o prisutnosti drugih spojeva u uzorku, jer je apsorpcija potonjeg stabilna tijekom vremena. Ova metoda zahtijeva upotrebu kinetičkog fotometra, na primjer Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, poluautomatskih analizatora, kao što je Clima 15, ili automatskih biokemijskih analizatora. Mjerenje koncentracije glukoze iz pune krvi praktično se provodi pomoću instrumenata čije se djelovanje temelji na amperometrijskom principu mjerenja, koristeći posebne enzimske senzore. Vodikov peroksid je izuzetno nestabilan kemijski spoj i može poslužiti kao izvor nabijenih čestica. To je ono što se koristi u enzimskim senzorima membranskog tipa ili u elektrokemijskim elementima prijenosnih glukometara.

Uzorak pune krvi (obično 20 µl) je razrijeđen u sistemskoj otopini pufera (crvena krvna zrnca su uništena), a zatim kroz liniju dovedena u protočnu ćeliju. Glukoza se podvrgava oksidaciji pod utjecajem enzima glukoza oksidaze, koji se nalazi na membrani. Dobiveni vodikov peroksid difundira kroz membranu i dalje se oksidira u katalitičkoj reakciji pod djelovanjem platine. Difuzija vodikovog peroksida na površini platine tvori struju proporcionalnu broju molekula H₂oh₂. Tako dobiveni signal obrađuje uređaj na odgovarajućoj vrijednosti napona. Ova izmjerena vrijednost je proporcionalna koncentraciji glukoze u uzorku.

Kao primjer instrumenata koji koriste gore opisanu metodu možemo spomenuti bioseničke glukozne analizatore (Njemačka). Ovi uređaji su prikladni za uporabu ne samo u bolnicama, već iu poliklinikama, gdje se testiranje glukoze vrši uglavnom iz kapilarne krvi.

Važan korak u razvoju kliničkih laboratorijskih dijagnostičkih metoda bio je nastanak "suhe kemije". Naravno, jedna od prvih primjena ove tehnologije bio je zadatak određivanja glukoze u krvi pacijenta. Prvi uređaji bili su značajno inferiorniji u odnosu na tradicionalne laboratorijske metode istraživanja. Međutim, tijekom vremena, jedan broj tvrtki uspio je razviti takve dijagnostičke trake i reflektirajuće fotometre, što je omogućilo vrlo visoku točnost analize. One Touch glucometers i Life Scan (USA) test trake su vrlo popularne diljem svijeta i uspješno kombiniraju analitičku točnost kvantitativne enzimske metode sa brzinom i jednostavnošću "suhe kemije".

Mjerači glukoze u krvi tvrtke One Touch dizajnirani su za brzo i točno mjerenje razine glukoze u krvi. One Touch test traka sadrži sve potrebne kemijske komponente za dvostupanjsku metodu glukozne oksidaze, uključujući enzime glukoza oksidaze i peroksidaze, koji se adsorbiraju na jedinstvenu poroznu hidrofilnu membranu. Rezultat reakcije je stvaranje obojenog kompleksa. Intenzitet razvijene boje bilježi se reflektirajućim minifotometrom.

Membranska test traka One Touch nalikuje spužvi s mikroskopskim porama i obavlja trostruku funkciju. Djeluje: 1) kao spremnik, sakupljajući potrebnu količinu krvi, 2) kao filter, blokirajući čvrsti stanični materijal (eritrociti, leukociti, itd.), 3) kao glatku optičku površinu na kojoj se mjeri reflektirano svjetlo. Posebno je potonja funkcija vrlo važna za rad uređaja. Omogućuje čitanje donjeg dijela trake, dok krv ostaje na gornjem dijelu test trake. Prema tome, nema potrebe oprati (blot) krv s površine test trake.

Osim toga, membrana ima hidrofilna svojstva, zbog čega se kap krvi "privlači" na površinu test trake kada je dodirne.

Uređaj One Touch uključuje dvije posebne LED diode. Obrada razvijene boje na test trakama je kako slijedi. Čim se testna traka umetne u uređaj, dolazi do očitavanja nule. U ovom trenutku na zaslonu vidimo: “ČEKAJ”. Kada se kap krvi stavi na test traku, krvna plazma se trenutno sorbira na membrani, dok eritrociti i višak plazme ostaju na površini membrane. Nakon potpune apsorpcije kapi krvi odmah dolazi do bojenja. Uređaj bilježi promjenu veličine refleksije i automatski pokreće mjerač vremena. Nakon 45 sekundi, kemijska reakcija završava, a rezultat refleksije svjetlosti se obrađuje. Obojeni reakcijski proizvod apsorbira svjetlost koju emitira prva LED. Krvne stanice i višak plazme također apsorbiraju svjetlost koju emitira dioda. Da bi se ispravila pozadinska refleksija, drugo očitavanje se izvodi pomoću druge LED na drugoj valnoj duljini. Razlika između signala prvog i drugog LED-a nosi informaciju o apsorpciji svjetla od strane kromogena. Signal dobiven od kromogena za procjenu koncentracije glukoze korelira s posebnom kalibracijom. Svi One Touch uređaji kalibrirani su pomoću referentne metode na laboratorijskom analizatoru glukoze. Ovim postupkom dobiva se standardna krivulja umjeravanja. Treba napomenuti da je vrlo teško uspostaviti proizvodnju test traka, koje bi bile apsolutno iste kemijski, zbog vrlo niske koncentracije reagensa. Za rješavanje ovog problema koristi se standardna kalibracijska krivulja koja se sastoji od 16 kalibracijskih linija. Kontrola kvalitete provodi se odmah nakon izrade test traka, što omogućuje da se odredi koja od kalibracijskih linija (od 1 do 16) se može primijeniti na ovu test traku. To je takozvani kodni broj, koji je pričvršćen na pakiranje test traka. Ovih 16 linija za kalibriranje također su programirane u mikroprocesoru instrumenta. Da biste dobili optimalno točne rezultate, kodni broj naveden na pakiranju test traka postavlja se u uređaj pomoću gumba za kod. Dakle, pogrešno instaliran kod na instrumentu može uzrokovati pogrešku mjerenja.

Od dolaska One Touch uređaja na tržište, prošao je velik broj kliničkih studija u laboratorijima Rusije, Amerike i Europe. Jednu od takvih studija proveo je Endokrinološki znanstveni centar Ruske akademije medicinskih znanosti na zahtjev Ruske udruge medicinske laboratorijske dijagnostike. Stručnjaci Centra proveli su komparativnu analizu dvije metode za mjerenje razine glukoze u krvi. Rezultati dobiveni na One Touch uspoređeni su s podacima dobivenim na biokemijskom analizatoru Spectrum II (Abbott Laboratories, SAD), koji provodi heksokinaznu metodu za određivanje glukoze. Pregledano je 190 uzoraka krvi od 95 bolesnika. Koeficijent korelacije rezultata bio je 0,98641. Koeficijent varijacije u normalnom i patološkom rasponu na One Touch metru ne prelazi 2,5%.

U službenom izvješću Centra za endokrinološka istraživanja Ruske akademije medicinskih znanosti navodi se: “One Touch uređaji imaju visoku točnost i točnost, kao i širok raspon mjerenja. Mogu se koristiti za dijagnosticiranje izvanrednih stanja kod dijabetesa, uključujući i hitne timove, jer ti uređaji nisu samo pouzdani, nego i brzo daju rezultate.

Metoda heksokinaze

Registracija se provodi na valnoj duljini od 340 nm na apsorpciju NADH. Ova metoda je vrlo specifična i ne reagira s drugim komponentama krvnog seruma. Metoda heksokinaze smatra se referencom za određivanje glukoze. U pravilu, to je linearno do 50 mmol / l, što mu je omogućilo da se široko preporuči za klinike s endokrinološkim odjelima.

Od opisanih različitih metoda za određivanje glukoze, djelatnici QDL-a mogu sami odlučiti koja metoda određivanja i koji uređaj odabrati:

Metode "mokre" biokemije, provedene na automatskim biokemijskim analizatorima, osigurat će potrebe laboratorija s velikim protokom analiza.
Analizatori glukoze tipa Biosen zahtijevaju minimalan napor operatora jer su potpuno automatizirani i dovoljno produktivni (brzina od 50 do 200 uzoraka na sat).
Za laboratorije s malim brojem studija, kao i ekspresne laboratorije, pogodan je specijalizirani biokemijski fotometar Mikrolab 540.
Za timove pomoći, skrivanje pomoći je savršeno rješenje - mjerači glukoze u krvi, kao što je One Touch.

Dakle, zadatak QDL-a da osigura ne samo brzo, već i vrlo precizno određivanje glukoze, danas je potpuno rješiv.

Glukoza u krvi, urin, liker

Glukoza u krvi je strogo kontrolirana.

Kontrola koncentracije glukoze u krvi provodi se pod utjecajem živaca i hormona.

Nervozna regulacija

Živčana regulacija koncentracije glukoze u krvi izražena je u pozitivnom učinku n.vagusa na izlučivanje inzulina i inhibicijskom učinku na taj proces simpatičke inervacije. Osim toga, oslobađanje adrenalina u krv je podložno simpatičnim utjecajima.

Hormonska regulacija

Glavni hormonski regulacijski čimbenici su glukagon, adrenalin, glukokortikoidi, somatotropni hormon s jedne strane i inzulin s druge strane. Svi hormoni, osim inzulina, koji pogađaju jetru, povećavaju glikemiju.

Inzulin je jedini hormon u tijelu koji ima za cilj snižavanje razine glukoze u krvi. Svojim utjecajem glukoza se jako apsorbira u mišiće i masno tkivo.

Smanjenje koncentracije glukoze u krvi inzulinom postiže se na sljedeće načine:

prijelaz glukoze u stanice - aktivacija GluT 4 transporter proteina na citoplazmatskoj membrani,
uključivanje glukoze u glikolizu - povećanje sinteze glukokinaze, enzima koji se naziva zamka glukoze, stimulacija sinteze drugih ključnih glikoliznih enzima - fosfruktokranaze, piruvat kinaze,
povećana sinteza glikogena - aktivacija glikogen sintaze i stimulacija njegove sinteze, što olakšava pretvaranje viška glukoze u glikogen,
aktivacija puta pentoznog fosfata - indukcija sinteze glukoza-6-fosfat dehidrogenaze i 6-fosfoglukonat dehidrogenaze,
povećana lipogeneza - uključenost glukoze u sintezu triacilglicerola ili fosfolipida.

Mnoga tkiva su potpuno neosjetljiva na djelovanje inzulina, nazivaju se neovisna o inzulinu. To uključuje živčano tkivo, staklasto tijelo, leću, mrežnicu, glomerularne stanice bubrega, endotelne stanice, testise i crvene krvne stanice.

Glukagon povećava glukozu u krvi:

povećanje mobilizacije glikogena putem aktivacije glikogen fosforilaze,
poticanje glukoneogeneze - povećanje rada enzima piruvat karboksilaze, fosfoenolpiruvat karboksikinaze, fruktoza-1,6-difosfataze.

Adrenalin uzrokuje hiperglikemiju:

aktiviranje mobilizacije glikogena - stimulacija glikogen fosforilaze,

Glukokortikoidi povećavaju razinu glukoze u krvi

suzbijanjem prijelaza glukoze u stanicu,
poticanje glukoneogeneze - povećanje sinteze enzima piruvat karboksilaze, fosfoenolpiruvat karboksikinaze, fruktoza-1,6-difosfataze.

Tablica sažima glavne aspekte hormonskih utjecaja:

Aktivacija glikogenolize u jetri;
Stimulacija glukoneogeneze;

Povećana glukoneogeneza;
Smanjena propusnost membrane prema glukozi.

Glukoza u krvi u kliničkoj praksi

Više od 90% svih topljivih ugljikohidrata krvi niske molekulske mase su glukoza; osim toga, fruktoza, maltoza, manoza i pentoza mogu biti prisutni u malim količinama, au slučaju patologije, galaktoza. Zajedno s njima u krvi sadrži polisaharide povezane s proteinima.

Osobito se intenzivno konzumira glukoza i koristi se za različite potrebe tkiva središnjeg živčanog sustava, crvenih krvnih zrnaca, moždine bubrega. U srednjem metabolizmu glukoza se koristi za tvorbu glikogena, glicerola i masnih kiselina, aminokiselina, glukuronske kiseline i glikoproteina. Koncentracija glukoze u krvi je derivat glikolize i oksidacije trikarboksilnih kiselina u TCA ciklusu, glikogeneza i glikogenoliza u jetri i mišićnom tkivu, glukoneogeneza u jetri i bubrezima i unos glukoze iz crijeva.

U kliničkoj praksi obično se ispituje razina glukoze u krvi, koncentracija drugih šećera i glikogena koristi se mnogo rjeđe. U ljudskoj krvi glukoza je prilično ravnomjerno raspoređena između plazme i formiranih elemenata, utvrđeno je da je sadržaj šećera u venskoj krvi 0,25-1,0 mmol / l (u prosjeku 10%) manji nego u arterijskoj i kapilarnoj krvi. Dijagnostička vrijednost je definicija mliječne i piruvične kiseline, aktivnost brojnih enzima metabolizma ugljikohidrata, sijalne i heksuronske kiseline, seromucoida, glikoziliranog hemoglobina i drugih pokazatelja.

Sadržaj glukoze u urinu ovisi o njegovoj koncentraciji u krvi, iako se izlučuje u normalnim i povišenim razinama šećera u krvi. S povećanjem koncentracije glukoze u krvi prevladava tzv. Bubrežni prag (kod zdravih ljudi leži u području 8,3–9,9 mmol / l) i javlja se glukozurija. Kod arteriosklerotičnog bubrega, s dijabetesom, povišenje praga i glukozurija ne može se zabilježiti čak ni s povećanjem koncentracije glukoze na 11.0-12.1 mmol / l.

Metode za određivanje glukoze u krvi

Metode za određivanje glukoze u krvi podijeljene su u tri skupine: redukcija, kolorimetrijska i enzimska.

Metode redukcije (Treba imati na umu da metode ove skupine daju precijenjene rezultate (za oko 20-25%), jer krv sadrži niz spojeva koji se ne odnose na ugljikohidrate, ali imaju reducirajuća svojstva (mokraćna kiselina, glutation, kreatinin, askorbinska kiselina). kiselina)):
- Hatedorn-Jensen-ova titrometrijska metoda temelji se na svojstvu šećera da se vrati, kada se kuha u alkalnom mediju, kalijeve soli željeza i sina i željeza-sludinata. Prema stupnju tog oporavka, koncentracija šećera u krvi ispitana je titrometrijom. Važna prednost metode je njegova niska cijena i mogućnost korištenja u bilo kojem laboratoriju;
- bazirano na redukciji nitrobenzena, na primjer pikrinske kiseline do pikramske kiseline;
- Postupak koji se temelji na sposobnosti glukoze da reducira soli bakra. Dobiveni monovalentni bakar djeluje kao intermedijer. Oksidirajući kisikom iz zraka, vraća arsen-molibdičnu kiselinu ili fosfo-tungističku kiselinu koja služi kao konačni kromogen.
Kolorimetrijske metode. To uključuje:
- Somodzhi metoda - reakcija redukcije bakra, koji se nalazi u sastavu bakrenih orthronskih reagensa, na bakrov oksid. Metoda je zahtjevna, višestruka, nespecifična i praktički se trenutno ne koristi;
- Folin-Wu metoda - redukcija bakrenog tartarata na litijev oksid. Metoda je jednostavna, nedostatak je nedostatak stroge proporcionalnosti između intenziteta dobivene boje i koncentracije glukoze;
- određivanje koncentracije glukoze prema Morrisu i Roeu - dehidracija glukoze pod djelovanjem sumporne kiseline i njezina transformacija u oksimetilfurfural, koja se kondenzira s artronom u plavi spoj. Zahtijeva najčišće reagense i strogo pridržavanje konstantne reakcijske temperature;
- Gultmanova ortotoluidinska metoda u modifikaciji Khivarinen-Nikkil, koja se sastoji u određivanju intenziteta bojenja otopine koja se javlja kada aromatski amin ortotoluidin stupa u interakciju s aldehidnom skupinom glukoze u kiselom mediju. Ova metoda je točna i omogućuje specifičnije određivanje glukoze.
- Metoda anilina zadržava osjetljivost ortotoluidinske metode, ali je još specifičnija.
Enzimske metode:
- na temelju reakcije heksokinaze. Glukoza pod djelovanjem heksokinaze je fosforilirana s ATP, rezultirajući Gl-6-F u prisutnosti dehidrogenaze vraća NADP. Količina ovog posljednjeg određena je povećanjem apsorpcije svjetlosti u ultraljubičastom području. Metoda je preskupa za praktične laboratorije.
- na temelju oksidacije glukoze u glukuronsku kiselinu upotrebom enzima glukoza oksidaze i nastajanja tijekom reakcije vodikovog peroksida, koji (u različitim verzijama):
  - određuje se kemijskim sredstvima;
  - uz sudjelovanje peroksidaze, oksidira bezbojni ortotolidin, pretvarajući ga u zeleno-plavu obojenu tvar, ravnost ovisnosti boje o koncentraciji glukoze ostaje u rasponu od 1,1 do 22 mmol / l;
  - u prisutnosti fenola uz sudjelovanje peroksidaze, oksidira 4-aminoantipirin u obojeni spoj boje grimizne boje;
  - u prisutnosti bakrenih iona, oksidira fenolftalin u fenolftalein, koji je obojen crveno pod alkalnim uvjetima.
Elektrokemijske metode koje koriste elektrode koje sadrže imobilizirane enzime, osobito glukoza oksidazu. Reakcija je zabilježena količinom stvorenog vodikovog peroksida ili gubitkom kisika potrošenog za oksidaciju glukoze.
Dijagnostičke trake koriste reakciju glukoza oksidaze i peroksidaze i derivate benzidina kao kromogen.

Usvojene su tri metode kao jedinstvene: metodom Haggedorn-Jensenove titrometrije, metodom orto-toluidina i metodom o-tolidin glukoza oksidaze.

Određivanje glukoze metodom ortotoluidina

načelo

Glukoza pri zagrijavanju s ortotoludom u prisutnosti sumporne kiseline daje plavo-zelenu boju.