Tehnologija proizvodnje inzulina

Analize

Inzulin je jedan od hormona koje proizvodi ljudsko tijelo, posebno gušterača. Kršenje izlučivanja ove tvari dovodi do pojave tako ozbiljne bolesti kao što je dijabetes. Za svoje liječenje koristeći sintetički hormon, koji je dugo vremena izoliran od gušterače stoke. Međutim, tehnologija za proizvodnju inzulina uz pomoć vrlo česte bakterije - Escherichia coli ili gljivice kvasca koristi se već duže vrijeme. Koristeći ovu metodu možete izbjeći alergijske reakcije uzrokovane stranim proteinom, koji ima malu razliku od čovjeka.

Tehnološka shema

Tehnologija proizvodnje inzulina uključuje sve glavne faze proizvodnje biotehnoloških proizvoda. Rezultat je kristalni krajnji produkt, koji se zatim koristi za pripremu injekcijskih otopina koje se koriste u liječenju teškog dijabetesa melitusa tipa I i II. Glavni učinak ovog hormona u tijelu očituje se u smanjenju razine glukoze sadržane u krvi.

Faze proizvodnje inzulina bit će sljedeće:

Preliminarni. On obavlja poslove kao što su priprema i pročišćavanje vode i zraka, čišćenje industrijskih prostora i sterilizacija opreme, kontrola osoblja, obrada ruku i izdavanje sterilnih cipela i odjeće. Također u preliminarnoj fazi, vrši se primarna kemijska sinteza molekularnih lanaca iz kojih se skupi protein. Lanac A sadrži 21 aminokiselinski ostatak, a lanac B sadrži 30 aminokiselina.
Priprema hranjivih otopina i kulture stanica. Da bi živa stanica proizvela potreban spoj, uveden je odgovarajući gen. Za to, plazmid je odrezan posebnim enzimima, restrikcijama, a u njega su ušiveni geni koji kodiraju sintezu potrebnih spojeva. Zatim se, pomoću metode mikroinjekcije, modificirani plazmid vraća u stanicu.
Uzgoj suspenzije stanica. Genetski modificirane stanice stavljaju se u hranjivu otopinu, imaju sve sastojke potrebne za rast i razmnožavanje i prolaze kroz sterilizaciju. Uzgoj kulture odvija se u posebnim bioreaktorima, gdje se dovodi pročišćeni zrak. Povremeno se u reaktor doda određena količina hranjive otopine i istodobno se povuče isti volumen suspenzije stanica.
Dodjela kulture. Odvajanje tekućine i stanične kulture provodi se sedimentacijom (sedimentacijom) u posebnim sedimentatorima, a zatim filtracijom, što omogućuje očuvanje cjelovitosti stanica.
Kromatografsko pročišćavanje tvari. Izvodi se na odgovarajućoj opremi, primjenom različitih metoda, osobito frontalnom, anionskom izmjenom i gel permeacijskom kromatografijom.
Dobivanje molekula proteina. Na samom biotehnološkom stupnju dolazi do sinteze neproduktirane molekule inzulina. I dvije komponente njegovih lanaca. Šive se nakon oksidacije i savijanja dobivenih lanaca, što rezultira stvaranjem disulfidnih mostova.
Sušenje smrzavanjem u posebnoj peći, nakon čega se dobiveni kristalni pripravak provjerava sukladnosti sa standardom, pakira, označava i otprema potrošaču.

Naša tvrtka po povoljnim uvjetima nudi gotove proizvodne linije, gdje se u potpunosti poštuje sva tehnologija proizvodnje inzulina. Zahvaljujući preciznim izračunima, tehničkoj i informacijskoj podršci, kao i obuci osoblja u okviru sveobuhvatnog programa, tvrtka će biti profitabilna, a njezini će proizvodi biti traženi.

Otkriće inzulina

Danas, dijabetes pogađa više od 400 milijuna ljudi na planeti, što je oko 8% odrasle populacije svijeta. Prema državnom registru, više od 3,3 milijuna ljudi boluje od dijabetesa u Rusiji (oko 300 tisuća ljudi pati od dijabetesa tipa 1, a oko 3 milijuna ljudi pati od dijabetesa tipa 2). Međutim, te brojke vjerojatno neće odražavati stvarno stanje. Svi ti ljudi, koji žive svaki dan, shvaćaju da njihov život ovisi o inzulinu.

Prvi pokušaji liječenja dijabetesa napravljeni su prije naše ere. Drevni grčki i rimski liječnici koristili su ovu masažu, gimnastiku, kupke, aromaterapiju i još mnogo toga. U 19. stoljeću za dijabetičare je razvijena mesna dijeta s malo ugljikohidrata. Prvi pokušaj liječenja dijabetesa injekcijama inzulina napravljen je 1921. Kanadski znanstvenik Frederick Banting postao je prva osoba koja je koristila hormon inzulina za kontrolu dijabetesa. Imao je samo 32 šifre kada je dobio Nobelovu nagradu za medicinu. Učinio je lijek učinkovito i bez nuspojava smanjio razinu glukoze s 28,9 na 6,7 mmol / l. Ovaj je lijek mnogima dao nadu za život.

Godine 1869. znanstvenik Paul Langergans otkrio je skupine stanica u gušterači, koje su kasnije nazvane po njemu "Langerhansovi otoci". Inzulin je zatim izoliran iz stanica tih otočića. Inzulin je hormon koji regulira metabolizam, prvenstveno ugljikohidrata (šećera), ali i masti i proteine. Kod dijabetesa, zbog nedovoljne izloženosti inzulinu, javlja se složeni metabolički poremećaj, povećava se razina šećera u krvi (hiperglikemija), šećer se izlučuje u mokraći (glikozurija), au kiselim ketonskim tijelima (ketoacidoza) pojavljuju se kiseli produkti oštećenja masnoće.

Nakon otkrića inzulina, mnogi znanstvenici su počeli razvijati metode čišćenja ovog lijeka, budući da onečišćenja djeluju štetno na oslabljeno tijelo.

Agilent Technologies je globalni lider u analitičkoj opremi. Uređaji za kromatografsku i spektralnu analizu već više od godinu dana pomogli su znanstvenicima širom svijeta u rješavanju vitalnih problema lijekova. Kontrola čistoće inzulina nije iznimka. Prethodno je za te svrhe korištena klasična tekućinska kromatografija, a dobiveni su sasvim prihvatljivi rezultati:

Nakon mnogo istraživanja, znanstvenici su dokazali da se formirani polipeptid inzulina s molekularnom težinom od oko 6000 učinkovito identificira koristeći najnovija dostignuća u području isključive kromatografije.

S ovom novom metodom može se usporediti “dobar inzulin”, koji je pohranjen u preporučenim uvjetima i “loš inzulin”. Kada su se dva kromatograma superponirala jedan na drugi, pokazalo se da je u pripravku inzulina, koji je pohranjen pod nepovoljnim uvjetima, ciljna molekula bila uništena i umjesto toga, na kromatogramu su identificirani produkti raspadanja.

Razvoj i unifikacija metoda za analizu i standardizaciju pripravaka inzulina korištenjem reverzno-fazne tekućinske kromatografije (RP HPLC) Pikhtar Anatolij Vasiljevič

Ova disertacija bi trebala uskoro otići u knjižnicu.
Obavijestite o prijemu

Teza - 480 rubalja., Dostava 10 minuta, 24 sata dnevno, sedam dana u tjednu i praznici.

Sažetak - 240 rubalja, dostava 1-3 sata, od 10-19 (moskovsko vrijeme), osim nedjelje

Pihtar Anatolij Vasiljevič. Razvoj i unifikacija metoda za analizu i standardizaciju pripravaka inzulina primjenom reverzno-fazne visokotlačne tekućinske kromatografije (RP HPLC): disertacija. Kandidat za farmaceutske znanosti: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Vasiljevič; [Mjesto zaštite: Moskovska medicinska akademija].- Moskva, 2005.- 139 str.: Il.

Sadržaj disertacije

POGLAVLJE 1. Pregled literature 11

1. Uloga inzulina u liječenju šećerne bolesti 11

2. Biosinteza i biološko djelovanje inzulina 12

3. Opće karakteristike fizikalno-kemijskih i farmaceutskih svojstava inzulina 15

4. Pripravci inzulina 24

5. Metode proizvodnje, standardizacija i kontrola kvalitete pripravaka inzulina 31

6. Upotreba HPLC u farmaceutskoj analizi inzulina. 46

POGLAVLJE 2. Izjava o problemu 50

POGLAVLJE 3. Ispitivanje utjecaja različitih čimbenika na kromatografsko ponašanje inzulina u uvjetima RP HPLC 56

1. Metode i materijali 57

2. Rasprava o rezultatima 62

2.1. Utjecaj sastava puferne otopine 62

2.2. Učinak koncentracije natrijevog sulfata 68

2.3. Učinak temperature kromatografske kolone 70

2.4. Učinak organskog modifikatora 75

2.5. Utjecaj duljine alkilnog radikala cijepljene faze 80

2.6. Utjecaj duljine kromatografske kolone 80

POGLAVLJE 4. Poboljšanje farmakopejskih metoda za analizu pripravaka inzulina na temelju primjene RP HPLC 82

1. Izbor optimalnih uvjeta za kromatografsko određivanje inzulina i njegovih nečistoća u medicinskim pripravcima 82

2. Mjeriteljske značajke metode 84

3. Primjena razvijene metodologije za testiranje službenih pripravaka inzulina 95

POGLAVLJE 5. Razvoj metoda za analizu oblika za injektiranje doziranja izofan-inzulina na temelju PF HPLC metode

1. Izbor uvjeta za kromatografsko određivanje protamina u doznim oblicima izofan-inzulina 110

2. Ispitivanje kromatografskih profila protamina izoliranih iz različitih vrsta riba 121

3. Postupak za određivanje protamina u pripravcima izofan-inzulina 123

4. Validacija razvijene metodologije 125

Opći zaključci t

Literatura 139

Opće značajke fizikalno-kemijskih i farmaceutskih svojstava inzulina

S kemijske točke gledišta, inzulin je mali globularni protein molekulske mase do 6000 Da. Istodobno, treba napomenuti da je inzulin uobičajeni naziv za cijelu obitelj homolognih proteina prirodnog i umjetnog porijekla sa zajedničkom karakterističnom biološkom aktivnošću. Proteinska priroda inzulina uspostavljena je 1928. godine [52]. To je među proteinima koji proizvode biuretnu reakciju i Paulinu reakciju. Struktura inzulina u potpunosti je uspostavljena ranih 50-ih. Elementarni kemijski sastav inzulina različitog podrijetla karakteriziraju brojke dane u tablici 1 [40].

Aminokiselinski sastav. Većina molekula inzulina sadrži 51 aminokiselinski ostatak, među kojima je 17 aminokiselina koje se nalaze u većini poznatih proteina.

Karakteristična značajka aminokiselinskog sastava goveđeg, svinjskog i humanog inzulina je triptofan i metionin. Aminokiselinski sastav ovih vrsta inzulina prikazan je u tablici 2 [40,46].

Nepromjenjiv je kod svih vrsta inzulina sadržaj cistina (6 polu-cistinskih ostataka). Osim toga, molekula inzulina svih vrsta sadrži 6 amidnih skupina (asparagin, glutamin).

Kada se inzulin oslobodi, zajedno s glavnom frakcijom, mogu se uočiti frakcije deamidiranih oblika inzulina. U kiselom okruženju, u procesu deamidacije, može se postupno odvojiti svih 6 amidnih skupina, a elektroforetska i kromatografska pokretljivost promjene inzulina [40]. Formiranje deamidiranih oblika inzulina može se procijeniti na temelju rezultata određivanja amonijaka. Za potpuno amidni oblik inzulina određeno je 6 mol amonijaka na 1 mol proteina, a za deamidirane oblike ova vrijednost može biti od 5 do 0.

Primarna struktura inzulina. Primarnu strukturu inzulina dešifrirala je skupina Sanger 1945-1955. Koristeći brojne kromatografske metode koje su omogućile razdvajanje i identifikaciju različitih peptida, aminokiselina i njihovih derivata, Sanger je uspio ustanoviti primarnu strukturu goveđeg inzulina [130,131,132,133,134,135]. Daljnja istraživanja inzulina različitog podrijetla korištenjem različitih fizikalno-kemijskih metoda, uključujući Edmanovu metodu za određivanje pune sekvence aminokiselina u dugim peptidima, potvrdila su nalaze Sanger-a i njegovih koautora o strukturi inzulina [bb].

Do danas je primarna struktura inzulina određena u predstavnika 24 vrste koje pripadaju 4 klase životinja: sisavaca, ptica, riba i ciklostoma [14]. Istraživanje o inzulinu različitog porijekla nastavlja se [71,72,73].

Struktura inzulina kod različitih životinja je slična, ali nije identična. U svojoj primarnoj strukturi, humani inzulin je sličan svinjskom, pasmom, kitovima i zečjim insulinima, koji se razlikuju samo u jednoj aminokiselini [40]. Razlikuje se od inzulina goveda s tri aminokiseline. Ljudski inzulin u većoj mjeri nije sličan inzulinu gvinejske svinje, ptica i riba [40]. Razlike u aminokiselinskim sekvencama humanih, svinjskih i goveđih inzulina prikazane su u tablici 3.

Unatoč strukturnim razlikama, svi tipovi inzulina imaju sličnu biološku aktivnost, tj. uzrokuju hipoglikemijski učinak. Međutim, veličina prikazane biološke aktivnosti snažno ovisi o vrsti i kreće se od 11 IU / mg (inzulin iz Sjevernog mora) do 62 IU / mg (puran i pileći inzulin), dok je aktivnost humanog inzulina oko 25-30 IU / mg [40]. Što su veće razlike među vrstama, veća je razlika u biološkoj aktivnosti odgovarajućeg inzulina.

Funkcionalno aktivna molekula inzulina sastoji se od dva polipeptidna lanca (A i B lanci) koji su povezani disulfidnim vezama; jedna veza je formirana sa sedmim aminokiselinskim ostacima oba lanca, druga disulfidna veza formirana je pomoću 20. ostatka A-lanca i 19. ostatka B-lanca (Slika 2). Osim toga, u molekuli inzulina postoji i treća disulfidna veza, koja je intračna i povezuje ostatke 6. i 11. lanca A [59,117].

Sekundarna struktura Različitim fizikalno-kemijskim i fizikalnim metodama istraživanja pokazalo se da molekula inzulina ima visoko uređenu prostornu strukturu (konformaciju), što pridonosi provedbi specifičnih bioloških funkcija [14]. U molekuli nativnog inzulina istovremeno su prisutni i cc-helix i p-fold listovi. Osim toga, postoje područja s poremećenom strukturom i strukturom <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Kada se kisela otopina inzulina (pH 2,3-2,5) zagrije na temperaturi od +100 ° C i brzo ohladi na -80 ° C, stvara se tzv. Fibrilarni inzulin - potpuno neaktivan oblik hormona [27]. Uvođenje fibrilarnih inzulinskih vlakana u otopinu aktivnog inzulina uzrokuje spontano kvantitativno taloženje inzulina u obliku fibrila [14,17].

Metode proizvodnje, standardizacija i kontrola kvalitete pripravaka inzulina

Dobivanje životinjskih vrsta inzulina. Industrijska proizvodnja govedine i svinjskog inzulina uspostavljena je gotovo istodobno u nekoliko zemalja, ubrzo nakon otkrića inzulina 1921. godine [63]. Od tada, koncept dobivanja inzulina ostao je gotovo nepromijenjen (tablica b) [17, 18]. Sirovine za proizvodnju životinjskih vrsta inzulina su goveda gušterača koja se koristi za ishranu.

Najvažniji zadatak u proizvodnji inzulina je njegovo pročišćavanje - oslobađanje tvari iz srodnih nečistoća, koje smanjuju biološku aktivnost, uzrokuju imunološke reakcije ili su potencijalno opasne za zdravlje pacijenta. Na primjer, nakon nekoliko godina korištenja slabo pročišćenog inzulina u krvi pacijenta, može postojati do 5.000 IU inzulina vezanog na antitijela. Antitijela na inzulin značajno utječu na profil njezina djelovanja i time pridonose labilnom tijeku dijabetesa.

Prva metoda pročišćavanja inzulina bila je rekristalizacija u prisutnosti cinkovih soli. Godine 1945. pokazalo se da sedmostruka rekristalizacija inzulina značajno smanjuje razinu alergijskih reakcija u bolesnika u usporedbi sa službenim inzulinskim preparatima u to vrijeme [63].

Heterogenost uzoraka inzulina nakon kristalizacije i pojedinačne rekristalizacije prikazana je različitim metodama: protustrujna ekstrakcija (PE), distribucijska kromatografija (PX), ionsko-izmjenjivačka kromatografija (IOC), diskelektroforeza (DEP) i gel-kromatografija (GEC) [63].,

Utvrđeno je da su glavne popratne inzulinske nečistoće: proinzulin, njegovi međuprodukti, kovalentni dimer inzulina, mono-disamido inzulin, monoarginin i mono-etilen, kao i brojni visoko-molekularni spojevi koji nisu insulina. Opći zaključak iz rezultata istraživanja, uzimajući u obzir podatke o imunološkoj aktivnosti detektiranih nečistoća [138], bio je zaključak o potrebi dodatnog pročišćavanja inzulinskih tvari, tako da je pri analizi DEF i GEC metodama nađena jedna komponenta - odgovarajući inzulin.

Kako bi se riješio problem pročišćavanja inzulina 1950. godine, predložena je HEC metoda, a 1970. metoda anionske izmjene (AOX). Utvrđeno je da inzulin, pročišćen metodom AOX, sadrži oko 500 ppm (dijelova na milijun) nečistoća s aktivnošću proinzulina [137]. Dodatno pročišćavanje inzulina pomoću visokotlačne tekućinske kromatografije na obrnutim fazama (RP HPLC) smanjuje sadržaj imunogenih frakcija do granice njihove detekcije [63].

Pregled aktualnog razvoja na području kromatografskog pročišćavanja inzulina prikazan je u [96]. Inzulin, sekvencijalno pročišćen, koristeći IOC i GEC, naziva se monokomponentni inzulin [63]. Dobivanje humanog inzulina. Potraga za metodama za dobivanje humanog inzulina nastala je zbog dvije okolnosti. S jedne strane, hitnost sirovinskog problema u slučaju proizvodnje životinjskog inzulina, s druge strane, brzi razvoj znanosti u ovom području pružio je pravu priliku za život. 1979. i 1981 gotovo istodobno su razvijene dvije metode dobivanja humanog inzulina - biosintetski i polusintetski [102,108]. Godine 1981. tvrtka Novo Nordisk po prvi put u svijetu započela je serijsku proizvodnju ljudskog polusintetičkog inzulina. Metoda koju tvrtka koristi temelji se na enzimatskoj i kemijskoj zamjeni Al u molekuli svinjskog inzulina s ostatkom Tre [61]. Ova metoda izravno ovisi o dobivanju potrebne količine svinjskog inzulina, što smanjuje njegovu ekonomsku vrijednost. Mogućnost dobivanja humanog inzulina biosintetskom metodom pojavila se s razvojem tehnologije rekombinantne DNA [10]. Radovi na proizvodnji genetski modificiranog inzulina započeli su prije 25 godina. 1978. objavljeno je da je dobiven soj proinsou-ling štakora koji proizvodi E. coli. Godine 1979. Genentechove studije su mogle klonirati u E. coli gene za kodiranje aminokiselinskih sekvenci. inzulinski lanci A i B uključeni u p-halo-tacidaznu regiju plazmida pBR322 [10,102]. 1981. sintetiziran je proinzulinski gen-analog mini-C-proinzulina, u kojem je 35-člani C-peptid zamijenjen segmentom od šest aminokiselina: arg-arg-gly-ser-lys-arg i njegova ekspresija u E. coli. Godine 1982. Eli Lilly pokrenuo je prvu svjetsku industrijsku proizvodnju ljudskog inzulina koristeći tehnologiju dva lanca razvijenu u suradnji s Genentechom [102]. Trenutno je prikazana mogućnost dobivanja humanog inzulina uz pomoć različitih ekspresijskih sustava [3,10,101,102]. S ekonomskog stajališta, od posebne je važnosti uporaba genetski modificiranih sojeva gram-pozitivnih bakterija E.coli, od kojih se mnogi smatraju prekomjernim proizvodima [3]. Istovremeno je postignut značajan napredak kod stanica kvasca Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tablica 7 navodi glavne, zajedničke za različite metode proizvodnje rekombinantnog humanog inzulina, faze tehnološkog procesa [3,10,63].

Primjena razvijene metodologije ispitivanja službenih pripravaka inzulina

Visokotlačna tekućinska kromatografija (HPLC) je varijanta kolonske tekućinske kromatografije u kojoj mobilna faza - eluent - prolazi kroz sorbent ispunjavajući kolonu velikom brzinom zbog značajnog pritiska (do 400x105 Pa) na ulazu u kolonu [11].

Kao način analize složenih smjesa tvari, HPLC se pojavio prije nešto više od 30 godina. Primjena sorbenata promjera čestica od 3 - 10 μm uzrokovala je naglo povećanje učinkovitosti kromatografskog razdvajanja u usporedbi s klasičnom verzijom kolonske tekućinske kromatografije. Stoga se HPLC često naziva tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC). Instrumentalna obilježja primjene HPLC detaljno su opisana u brojnim priručnicima [49.50] i relevantnim odjeljcima vodeće farmakopeje [79,150]. Za HPLC je razvijen i proizvodi se širok raspon sorbenata. Prema autorima istraživanja [51] - oko 100 tvrtki širom svijeta proizvodi više od 300 vrsta imena sorbenta. Povijest, trenutno stanje i izgledi za razvoj metode opisani su u pregledima [51] i [77.78].

U različitim varijantama, HPLC metoda se široko koristi u farmaceutskoj analizi (kontrola proizvodnje i ispitivanje kvalitete lijeka). Metoda je uključena u sve vodeće farmakopeje svijeta. Ova metoda je najpotpunije opisana u Europskoj i Američkoj farmakopeji. HPLC se koristi za identifikaciju lijekova, za određivanje čistoće, frakcijskog sastava molekularne mase i kvantitativne analize. U US Pharmacopoeia 28 ed. oko 30% privatnih artikala uključuje korištenje HPLC. U Europskoj farmakopeji 4. izd. ova brojka je oko 40%.

Prva kromatografska metoda za ispitivanje inzulina bila je niskotlačna gel isključiva tekuća kromatografija (GE ZhND). Princip odvajanja pod uvjetima HPLC-a temelji se na različitoj sposobnosti molekula različitih veličina da prodiru u pore neutralnog gela, koji služi kao stacionarna faza. Hidrodinamički promjer inzulinskog monomera i dimera proporcionalan je njihovoj molekularnoj težini i iznosi 2,69 odnosno 5,50 nm [115].

Godine 1967. primjenom GE-IHDD metode pokazalo se da komercijalni pripravci inzulina, pročišćeni kristalizacijom, sadrže nečistoće molekulske mase veće od molekularne težine inzulina [63]. Na kromatogramu svinjskog inzulina nađena su tri pika, koji su uobičajeno označeni kao a-, b- i c-komponente. Od tada je predloženo više kromatografskih sustava za kontrolu sadržaja nečistoća visoke molekularne mase u pripravcima inzulina. Odvajanje je provedeno na visoko bubrićim agaroznim kserogelima (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Ili dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M otopine octene kiseline korišteni su kao IF [127]. Visoka osjetljivost ovih sorbenata na kompresiju pri tlaku koji prelazi tlak bubrenja matriksa čini te materijale neprikladnim za rad u HPLC modu.

Korištenje gel-ekskluzivne tekućinske kromatografije pri visokim tlakovima (GE HPLC) za analizu inzulina prvi je opisan 1980. godine, nakon razvoja tvrdih makroporoznih sorbenata kompatibilnih s vodom i izdržanih visokih tlakova. U [151], odvajanje je provedeno na kolonama Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) u uvjetima denaturacije (kombinacija 7 M otopine uree, mineralnih kiselina i neionskih). sredstva za čišćenje). Potreba za analizom inzulina u uvjetima denaturiranja povezana je sa sposobnošću inzulina da se agregira u otopini. Za odvajanje inzulina u uvjetima HPLC HPLC, također je opisana upotreba "tradicionalne" eluens octene kiseline [152]. Upotreba octene kiseline ima nekoliko prednosti - minimalan utjecaj na nativnu strukturu odvojenih spojeva, dostupnost, nisku cijenu, osim toga, važna činjenica je sposobnost octene kiseline da suprimira povezanost inzulina.

Trenutno je HPLC ghvd farmakopejska metoda za praćenje sadržaja nečistoća visoke molekularne mase u supstancama i gotovim oblicima doziranja. Metoda se također koristi za određivanje sadržaja protamina u pripravcima izofan-inzulina.

Korištenje HPLC na obrnutim fazama (RP HPLC) za razdvajanje goveda i svinjskog inzulina po prvi put pokazalo je visoku učinkovitost ove metode za analizu peptida sličnih inzulinu sa sličnom strukturom.

Mehanizam razdvajanja proteina i polipeptida u uvjetima RP HPLC temelji se na različitoj hidrofobnosti molekula inzulina i srodnih nečistoća. Do danas je opisano nekoliko desetaka metoda za kromatografsko razdvajanje inzulina različitog porijekla i njihovih derivata, uključujući proin-sulin, polipeptide gušterače, derivate dezamida, dimer inzulina. [126] pokazala je mogućnost odvajanja inzulina od piletine, zeca, ovaca i konja. Ljudski, goveđi i svinjski inzulin također su razdvojeni. Lloyd i Corran objavili su metodu za odvajanje govedine, svinjetine, humanih inzulina i njihovih odgovarajućih deamidiranih oblika [104].

Odvajanje se provodi na sorbetima silika gela modificirane, metil, butil, oktil, oktadecil i fenil skupine u izokratskom ili gradijentnom modu. Kao PF koriste se organski modifikatori - acetonitril, metil alkohol, izopropilni alkohol, pomiješani s vodenim puferskim otopinama koje sadrže anorganske soli i ionske pare. Detekcija vrha provodi se uglavnom spektrofotometrijskom metodom na valnoj duljini 190-220 nm, a opisane su i fluorimetrijske metode [103].

Analiza supstance i gotovih oblika doziranja inzulina pomoću RP HPLC opisana je u privatnim člancima u Američkoj i Europskoj farmakopeji [79,150]. Metoda se koristi za testiranje lijekova određene skupine u smislu "inzulinske autentičnosti", "srodnih proteina", "kvantitativnog određivanja" i "inzulina u otopini".

Istraživačka literatura također opisuje uporabu ionsko-izmjenjivačke i afinitetne kromatografije za analizu inzulina [44,102], međutim, te metode nisu naširoko korištene u farmakopejskoj praksi.

Izbor uvjeta za kromatografsko određivanje protamina u doznim oblicima izofan-inzulina

Povećanje ionske jakosti PF-a obično dovodi do povećanja omjera inzulinskih kapaciteta, što može biti uzrokovano brojnim čimbenicima: - povećanje koncentracije iona smanjuje stupanj ionizacije nabijenih skupina molekule proteina, povećavajući njegovu hidrofobnost / - visoka koncentracija kationa doprinosi probiranju slobodnih silanolnih skupina na površini faza koja slabi nespecifičnu elektrostatičku interakciju protoniranih amino skupina proteina s matricom; - visoka ionska snaga utječe na prostornu strukturu inzulina, što rezultira promjenom površine za interakciju sa sorbensom. Koncentracija anorganskih soli u FS utječe na oblik pikova i selektivnost odvajanja inzulina i desamido-Asn-inzulina [143, 144]. Sa izokratskim eluiranjem na sorbentu LiChrosorb Sív s 0,1 M otopinom natrijevog fosfata (pH 2,3), postignut je zadovoljavajući rezultat samo kada je natrijev sulfat dodan u otopinu pufera do koncentracije 0,1 M. Većina metoda analize inzulina uključenih u farmakopejske proizvode i ND, PF koristiti na osnovi pufernih otopina s sadržajem natrij sulfata jednakim 0,2 M. Takav visok sadržaj natrijevog sulfata negativno utječe na obnovljivost rezultata kromatografije zbog raslojavanja eluenata, štoviše, visoko koncentrirane otopine soli imaju negativan učinak na kromatografsku opremu, skraćujući njen vijek trajanja. S obzirom da su farmakopejske metode analize razvijene prije više od 20 godina, činilo se zanimljivim proučiti kromatografsko ponašanje inzulina pod OF-HPLC na kromatografskim sorbentima najnovije generacije, ovisno o koncentraciji natrijevog sulfata. Istodobno su pokušali otkriti je li dopušteno smanjenje sadržaja natrijevog sulfata u PF bez značajnog pogoršanja sposobnosti odvajanja kromatografskog sustava. Kao rezultat istraživanja utvrđeno je da je učinak koncentracije natrijevog sulfata u PF različit, ovisno o tipu cijepljene faze, kao io vrsti inzulina. Na sorbentima s cijepljenim skupinama C4 i C selektivnost odvajanja pikova humanog inzulina i desamido-Asn-humanog inzulina ne ovisi o koncentraciji natrijevog sulfata u. otopina pufera 1 u rasponu od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbensu Diaspher-110-C18, selektivnost odvajanja ovog para vrhova ima maksimum na 0,05 M i minimum na 0,1 M (grafikon 4). S druge strane, selektivnost odvajanja životinjskih vrsta inzulina i njihovih odgovarajućih desamidiranih AsnA21 oblika ne ovisi o ionskoj jakosti otopine kada je odvojena na sorbensu Diasphere-110-C18. Na sorbensu s C8 cijepljenim skupinama, selektivnost se povećava od 1,25 do 1,28 s povećanjem koncentracije natrij sulfata (slika 4). Na sorbentu s C4 cijepljenim skupinama, selektivnost separacije u slučaju goveđeg inzulina je maksimalna na 0,1 M natrijevog sulfata i minimalna na 0,2 M. Za svinjski inzulin nema izraženog maksimuma pri koncentraciji natrij sulfata od 0,1 M, u ovom slučaju povećanje ionskog sile su dovele do smanjenja selektivnosti odvajanja (slika 4). Broj učinkovitih teoretskih ploča povećava se s povećanjem koncentracije natrij sulfata. Izuzetak je ponašanje humanog inzulina na sorbensu Diasfer-110-C8 (slika 5). Stupanj razdvajanja pikova inzulina i desamido-Asn-inzulina raste s povećanjem ionske jakosti FS-a, bez obzira na vrstu inzulina i vrstu cijepljene faze (dijagram b). Smanjenjem koncentracije natrij sulfata od 0,2 M do 0,1 M, stupanj odvajanja odabranog para vrhova smanjuje se u prosjeku za 5% za humane i svinjske inzuline, te za 10% za goveđi inzulin. Uzimajući u obzir činjenicu da apsolutna vrijednost stupnja odvajanja prelazi 2,0, izmjerena pogoršanje kapaciteta odvajanja kolone, po našem mišljenju, nije značajno. Prema tome, koncentracija natrijevog sulfata u puferskoj otopini PF može se smanjiti 2 puta u usporedbi s farmakopejskim metodama analize.

U većini studija o analizi proteina i peptida, odvajanje se provodi na sobnoj temperaturi. Štoviše, neki autori ukazuju da je utjecaj temperature na selektivnost odvajanja minimalan [48]. Međutim, s porastom temperature ubrzava se proces razmjene masa između stacionarnih i pokretnih faza, što dovodi do smanjenja vremena zadržavanja peptida i sužavanja vrhova.

Tehnologija inzulina

Povreda izlučivanja inzulina. Korištenje affiliate fotografije. Shema za inzulin. Ekspresija proinzulina u E. coli stanicama. Pristupi rješavanju problema dijabetesa. Doprinos biotehnologije industrijskoj proizvodnji nepeptidnih hormona.

Pošaljite svoje dobro djelo u bazu znanja je jednostavno. Koristite donji obrazac.

Studenti, diplomski studenti, mladi znanstvenici koji koriste bazu znanja u studiranju i radu bit će vam vrlo zahvalni.

Objavljeno http://www.allbest.ru/

MINISTARSTVO ZA OBRAZOVANJE I ZNANOST REPUBLIKE KAZAHSTAN

KAZAČKA AGRO-TEHNIČKA SVEUČILIŠTA NAZIVA NAKON S.SEYFULLINA

Zavod za mikrobiologiju i biotehnologiju

O disciplini "Biotehnologija mokroorganizmov"

Na temu: tehnologija za inzulin

Dovršeno: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Provjereno: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

KRATICE I SIMBOLI

1. Povijest otkrića

2. Dobivanje inzulina u biotehnologiji

3. Načini dobivanja humanog inzulina

4. Ekspresija proinzulina u stanicama E. coli

5. Pročišćavanje inzulina

6. Doziranje i primjena

U ovom kolegiju korištene su sljedeće definicije:

Nositelj proteina - osigurava transport hibridnog proteina u periplazmičnom prostoru stanice ili medija kulture;

Afinitetna komponenta - značajno olakšava odabir hibridnog proteina.

Inzulin (od latinskog. Insula - otok) - peptidni hormon, formira se u beta stanicama Langerhansovih otočića gušterače.

Interleukini su skupina citokina sintetiziranih uglavnom leukocitima (zbog toga je odabran završni "-leukin").

Proinzulin je prekursor inzulina kojeg sintetiziraju B stanice insularnog aparata gušterače.

Kromatografija (od grčke. Chroma, chromatos - boja, boja), fizikalno-kemijska metoda odvajanja i analize smjesa, temeljena na raspodjeli njihovih komponenti između dvije faze - stacionarne i pokretne (eluent), teče kroz stacionarni.

Inkapsulacija - mehanizam programskog jezika koji ograničava pristup komponentama koje sačinjavaju objekt (metode i svojstva), čini ih privatnim, odnosno pristupačnim samo unutar objekta.

Fuzijski protein (fuzijski protein, također kimerni spoj proteina) je protein dobiven kombiniranjem dvaju ili više gena koji su izvorno kodirali odvojene proteine.

Hormoni (od grčkog. Hormao - pokretanje, poticanje), hormoni, biološki aktivne tvari koje proizvode endokrine žlijezde ili endokrine žlijezde, te ih izlučuju izravno u krv.

Šećerna bolest je skupina endokrinih bolesti koja se razvija kao posljedica apsolutne ili relativne nedostatnosti hormona inzulina.

Inkapsulacija - mehanizam programskog jezika koji ograničava pristup komponentama koje sačinjavaju objekt (metode i svojstva), čini ih privatnim, odnosno pristupačnim samo unutar objekta.

Somatostatin je hormon delta stanica Langerhansovih otočića gušterače, kao i jedan od hormona hipotalamusa.

Radioimunska analiza je metoda za kvantitativno određivanje biološki aktivnih tvari (hormona, enzima, lijekova, itd.) U biološkim tekućinama, koja se temelji na kompetitivnom vezanju željenih stabilnih i sličnih supstanci obilježenih radionuklidima specifičnim veznim sustavima.

KRATICE I SIMBOLI

HPLC - tekućinska kromatografija visokog učinka

cDNA - komplementarna deoksiribonukleinska kiselina

Glavna funkcija inzulina je osigurati propusnost staničnih membrana za molekule glukoze. U pojednostavljenom obliku, može se reći da se ne samo ugljikohidrati, nego i bilo kakve hranjive tvari, u konačnici, dijele na glukozu, koja se koristi za sintezu drugih molekula koje sadrže ugljik, te je jedina vrsta goriva za stanične elektrane - mitohondrije. Bez inzulina, propusnost stanične membrane do glukoze pada 20 puta, a stanice umiru od gladi, a višak šećera otopljen u krvi truje tijelo.

Oštećenje izlučivanja inzulina uslijed razaranja beta stanica - apsolutni nedostatak inzulina - ključni je element u patogenezi šećerne bolesti tipa 1. Povreda učinka inzulina na tkivo - relativni nedostatak inzulina - ima važno mjesto u razvoju dijabetesa tipa 2.

Korištenje afinitetne kromatografije značajno je smanjilo sadržaj kontaminiranih proteina u pripravku veće molekulske mase od inzulina. Takvi proteini uključuju proinzulin i djelomično rascijepljene proinzuline, koji su sposobni inducirati proizvodnju antiinsulinskih antitijela.

Korištenje humanog inzulina od samog početka terapije smanjuje pojavu alergijskih reakcija. Ljudski se inzulin brže apsorbira i, bez obzira na oblik lijeka, ima kraće trajanje djelovanja od životinjskog inzulina. Ljudski inzulini su manje imunogeni od svinjetine, osobito miješani goveđi i svinjski inzulini.

Svrha ovog kolegija je proučavanje tehnologije inzulina. Za postizanje sljedećih ciljeva:

1. dobivanje inzulina u biotehnologiji

2. Načini dobivanja inzulina

H. Pročišćavanje inzulina

Povijest otkrića inzulina povezana je s imenom ruskog liječnika I.M. Sobolev (druga polovica 19. stoljeća), koji je dokazao da je razina šećera u ljudskoj krvi regulirana posebnim hormonom gušterače.

Inzulin izoliran iz pankreasa životinje je 1922. godine prvi put uveden desetogodišnjem dječaku, dijabetičar je nadmašio sva očekivanja, a godinu dana kasnije američka tvrtka Eli Lilly izdala je prvi životinjski pripravak inzulina.

Nakon primanja prve industrijske serije inzulina u sljedećih nekoliko godina pokriven je golemi način njegove izolacije i pročišćavanja. Kao rezultat toga, hormon je postao dostupan za pacijente s dijabetesom tipa 1.

Godine 1935. danski istraživač Hagedorn optimizirao je djelovanje inzulina u tijelu predlaganjem produženog lijeka.

Prvi kristali inzulina dobiveni su 1952., a 1954. engleski je biokemičar G. Senger dešifrirao strukturu inzulina. Razvoj metoda za pročišćavanje hormona iz drugih hormonalnih tvari i proizvoda razgradnje inzulina omogućio je dobivanje homogenog inzulina, nazvanog jednokomponentni inzulin.

Ranih 70-ih. Sovjetski znanstvenici A. Yudaev i S. Shvachkin predložili su kemijsku sintezu inzulina, međutim, provedba ove sinteze u industrijskim razmjerima bila je skupa i neprofitabilna.

U budućnosti, došlo je do progresivnog poboljšanja u stupnju pročišćavanja inzulina, što je smanjilo probleme uzrokovane alergijama na inzulin, oštećenje funkcije bubrega, oštećenje vida i otpornost na imuni inzulin. Najučinkovitiji hormon bio je potreban za supstitucijsku terapiju kod šećerne bolesti - homolognog inzulina, odnosno ljudskog inzulina.

Osamdesetih godina prošlog stoljeća napredak u molekularnoj biologiji omogućio je sintezu oba ljudska lanca inzulina pomoću E. coli, koji su zatim bili spojeni u biološki aktivnu molekulu hormona, a rekombinantni inzulin je dobiven pomoću genetski modificiranih sojeva E. coli na Institutu za bioorgansku kemiju.

2. Dobivanje inzulina u biotehnologiji

Inzulin, peptidni hormon Langerhansovih otočića gušterače, glavni je lijek za dijabetes melitus. Ova bolest je uzrokovana nedostatkom inzulina i očituje se povećanjem razine glukoze u krvi. Do nedavno je inzulin dobiven od gušterače bika i svinje. Lijek se razlikovao od humanih zamjena za 1-3 amino kiseline, tako da je postojala opasnost od alergijskih reakcija, osobito kod djece. Velika terapijska upotreba inzulina bila je ograničena visokim troškovima i ograničenim resursima. Kemijskom modifikacijom, inzulin iz životinja nije se mogao razlikovati od čovjeka, ali to je značilo dodatno povećanje cijene proizvoda. [1]

Od 1982. Eli Lilly proizvodi genetski inzulinirani inzulin na temelju odvojene sinteze E. colie i B-lanaca. Trošak proizvoda je značajno smanjen, proizvedeni inzulin je identičan ljudskom. Od 1980. godine u tisku su objavljena izvješća o kloniranju gena proinzulina, prekursora hormona, koji prelazi u zrelu formu s ograničenom proteolizom.

Tehnologija enkapsulacije također je povezana s liječenjem dijabetesa: stanice gušterače u kapsuli, jednom uvedene u tijelo pacijenta, proizvode inzulin u roku od godinu dana.

Integrirana genetika pokrenula je proizvodnju hormona za stimulaciju folikula i luteinizirajućih hormona. Ovi peptidi se sastoje od dvije podjedinice. Na dnevnom redu je pitanje industrijske sinteze oligopeptidnih hormona živčanog sustava, ankefalina, izgrađenih od 5 aminokiselinskih ostataka, i endorfina, analoga morfina. Uz racionalno korištenje tih peptida olakšati bol, stvoriti dobro raspoloženje, povećati učinkovitost, koncentrirati pažnju, poboljšati pamćenje, staviti u red spavanja i budnosti. Primjer uspješne primjene metoda genetskog inženjeringa je sinteza β-endorfina korištenjem hibridne proteinske tehnologije opisane gore za drugi peptidni hormon, somatostatin [2].

3. Načini dobivanja humanog inzulina

Povijesno gledano, prvi način dobivanja inzulina u terapijske svrhe je izoliranje analoga tog hormona iz prirodnih izvora (otočići goveda i svinja gušterače). U dvadesetim godinama prošlog stoljeća ustanovljeno je da goveđi i svinjski inzulini (koji su najbliži ljudskom inzulinu u strukturi i aminokiselinskom slijedu) pokazuju aktivnost u ljudskom tijelu koja se može usporediti s humanim inzulinom. Nakon toga, goveđi ili svinjski inzulin korišten je dugo vremena za liječenje pacijenata s dijabetesom tipa 1. Međutim, nakon nekog vremena, pokazalo se da se u nekim slučajevima antitijela na inzuline goveda i svinje počinju akumulirati u ljudskom tijelu, čime se poništavaju njihovi učinci.

S druge strane, jedna od prednosti ove metode dobivanja inzulina je dostupnost sirovina (goveđi i svinjski inzulin može se lako dobiti u velikim količinama), što je imalo odlučujuću ulogu u razvoju prve metode dobivanja humanog inzulina. Ta se metoda naziva polusintetička [3].

U ovom postupku proizvodnje humanog inzulina kao sirovina korišten je svinjski inzulin. Pročišćeni svinjski inzulin se cijepa pomoću C-terminalnog oktapeptida B-lanca, nakon čega se sintetizira C-terminalni oktapeptid humanog inzulina. Zatim je kemijski vezan, zaštitne skupine su uklonjene i dobiveni inzulin je pročišćen. Kada se testira ovaj postupak dobivanja inzulina, pokazan je potpuni identitet hormona dobivenog s humanim inzulinom. Glavni nedostatak ove metode je visoka cijena rezultirajućeg inzulina (čak je i sada kemijska sinteza oktapeptida skupa, posebno u industrijskim razmjerima).

Trenutno se humani inzulin uglavnom dobiva na dva načina: modificiranjem svinjskog inzulina sintetičkom enzimskom metodom i metodom genetskog inženjeringa.

U prvom slučaju, metoda se temelji na činjenici da se svinjski inzulin razlikuje od humanog inzulina jednom supstitucijom na C-kraju A-30Thr B-lanca. Zamjena alanina s treoninom provodi se enzimski kataliziranim cijepanjem alanina i, umjesto toga, vezanjem ostatka treonina zaštićenog karboksilom u reakcijskoj smjesi u velikom suvišku. Nakon cijepanja zaštitne O-terc-butilne skupine dobiva se humani inzulin. (slika 1)

Slika 1 - Shema postupaka za proizvodnju humanog inzulina

Inzulin je bio prvi protein dobiven u komercijalne svrhe uporabom tehnologije rekombinantne DNA. Postoje dva glavna pristupa dobivanju genetski modificiranog ljudskog inzulina. U prvom slučaju, odvojeni (različiti sojevi proizvođača) proizvode oba lanca nakon čega slijedi preklapanje molekule (formiranje disulfidnih mostova) i odvajanje misoforma. U drugom, priprema u obliku prekursora (proinzulin) praćena enzimskim cijepanjem s tripsinom i karboksipeptidazom. U aktivni oblik hormona. Trenutno je najpoželjnija proizvodnja inzulina kao prekursora, koji osigurava ispravno zatvaranje disulfidnih mostova (u slučaju odvojene proizvodnje lanaca, uzastopni ciklusi denaturacije, razdvajanje misoforma i renaturacija se provode [3].

U oba pristupa, moguće je pojedinačno dobiti početne komponente (A i B lanci ili proinzulin), te kao dio hibridnih proteina. Pored A- i B-lanaca ili proinzulina, u sastavu hibridnih proteina mogu biti prisutni:

1) proteinski nosač - osiguravanje transporta hibridnog proteina u periplazmički prostor stanice ili medija kulture;

2) komponenta afiniteta - značajno olakšava odabir hibridnog proteina.

U isto vrijeme, obje ove komponente mogu biti istovremeno prisutne u sastavu hibridnog proteina. Osim toga, pri stvaranju hibridnih proteina može se koristiti princip višedimenzionalnosti (to jest, nekoliko kopija ciljnog polipeptida prisutno je u hibridnom proteinu), što omogućuje značajno povećanje prinosa ciljnog produkta [4].

Mi smo koristili soj JM 109 N1864 s nukleotidnom sekvencom ugrađenom u plazmid koji eksprimira hibridni protein, koji se sastoji od linearnog proinzulina i fragmenta fragmenta Astaphylococcusaureus proteina vezanog na njegov N-kraj kroz ostatak metionina. Uzgoj zasićene biomase stanica rekombinantnog soja osigurava početak proizvodnje hibridnog proteina, izolaciju i sekvencijalnu transformaciju čije intube dovodi do inzulina. Druga skupina istraživača primila je u bakterijskom ekspresijskom sustavu fuzijski rekombinantni protein koji se sastoji od humanog proinzulina i polihistidinskog repa vezanog uz njega preko ostatka metionina. Izolirana je kromatografijom na kelatu na Ni-agaroznim kolonama iz inkluzijskih tijela i digerirana je s cijanogen bromidom. Autori su utvrdili da je izolirani protein S-sulfidiran. Kartografija i analiza masene spektrometrije dobivenog proinzulina, pročišćene kromatografijom ionske izmjene na anionskom izmjenjivaču i RP (reverzna faza) HPLC (tekućinska kromatografija visokog učinka), pokazala je prisutnost disulfidnih mostova koji odgovaraju disulfidnim mostovima prirodnog humanog proinzulina. Također je izvijestila o razvoju nove, poboljšane metode za dobivanje humanog inzulina metodama genetskog inženjeringa u prokariotskim stanicama. Autori su otkrili da je inzulin dobiven u svojoj strukturi i biološkoj aktivnosti identičan hormonu koji je izoliran iz gušterače [5].

Nedavno je posebna pozornost posvećena pojednostavljenju postupka proizvodnje rekombinantnog inzulina metodama genetskog inženjeringa. Prema tome, fuzijski protein koji se sastoji od interleukinskog vodećeg peptida vezanog na N-kraj proinzulina dobiven je preko lizinskog ostatka. Protein se učinkovito eksprimira i lokalizira u inkluzijskim tijelima. Nakon izolacije, protein se cijepa sa tripsinom da se dobije inzulin i C-peptid. Druga skupina istraživača djelovala je na sličan način. Fuzijski protein koji se sastoji od proinzulina i dvije sintetičke domene Staphylococcus proteina A, koji vežu IgG, bio je lokaliziran u inkluzijskim tijelima, ali je imao višu razinu ekspresije. Protein je izoliran afinitetnom kromatografijom koristeći IgG i tretiran tripsinom i karboksipeptidazom B. Dobiveni inzulin i C-peptid su pročišćeni pomoću RP-HPLC. Pri stvaranju fuzijskih struktura, omjer mase nosača proteina prema ciljnom polipeptidu je vrlo značajan. Ovo je način na koji je opisan dizajn fuzijskih konstrukata, gdje je protein koji veže humani serumski albumin korišten kao nosač polipeptida. Na nju su vezani jedan, tri i sedam C-peptida. C-peptidi su kombinirani na bazi glave-repa koristeći aminokiselinske razmaknice koje nose Sfi I restrikcijsko mjesto i dva argininska ostatka na početku i na kraju razmaknice za daljnje cijepanje proteina s tripsinom. Produkti HPLC cijepanja pokazali su da se C-peptid cijepa kvantitativno, a to omogućuje korištenje metode multimernih sintetskih gena za proizvodnju ciljanih polipeptida u industrijskom mjerilu.

Dobivanje mutantnog proinzulina, koji je sadržavao zamjenu Arg32Tyr. Uz zajedničko cijepanje ovog proteina s tripsinom i karboksipeptidazom B, nastao je prirodni inzulin i C-peptid koji sadrže ostatak tirozina. Potonji, nakon 125I označavanja, aktivno se koristi u radioimunološkom testu [6].

Kontrola kvalitete inzulina

Sadržaj

1. Opće informacije o dobivanju inzulina 5

2. Metode koje se koriste za kontrolu kvalitete inzulina 8

Reference 17

Izvadak s posla

1-2% europske populacije pati od dijabetesa, a oko 20% tih pacijenata ne može postojati bez injekcija inzulina. Od prvih eksperimenata o uporabi inzulina za liječenje dijabetesa 1922. godine, taj je hormon izoliran iz gušterače životinja (krava i svinja). Životinjski inzulin se neznatno razlikuje u aminokiselinskom slijedu od humanog inzulina.

Ljudski i svinjski inzulini su posebno bliski: u svinjskom inzulinu, C-terminalni treonin B-lanca je zamijenjen alaninom. Krava i humani inzulin se razlikuju u tri aminokiselinska ostatka. Te razlike su odredile povećanu imunogenu aktivnost goveđeg inzulina u usporedbi sa svinjskim inzulinom.

Gotovo svi bolesnici koji su liječeni kravljim inzulinom imali su antitijela na inzulin u krvi. Antigenska svojstva inzulina također su djelomično određena nečistoćama u njegovim preparatima. Najvjerojatnije je formiranje antitijela na inzulin objasnilo neke manje nuspojave kod ubrizgavanja kravljeg inzulina, na primjer, atrofija potkožnog masnog tkiva na mjestu ponovnog ubrizgavanja. U slučaju visoko pročišćenog inzulina, ovi učinci nisu bili prisutni.

Nakon toga, zahvaljujući genetskom inženjeringu i korištenju E. Coli, dobiven je humani inzulin.

Humani inzulin, dobiven od E. coli, bio je prvi "genetski modificirani" protein ispitan u ljudi. U pokusima sa zdravim dobrovoljcima utvrđeno je da je siguran (ne uzrokuje alergijske i druge neželjene reakcije) i ima sposobnost smanjivanja razine glukoze u krvi kada se daje pod kožu ili intravenski.

Trenutno, takav humani inzulin dobivaju mnogi dijabetičari širom svijeta. Tome su prethodila klinička ispitivanja u kojima su proučavane metaboličke promjene i imunološki učinci.

Važnost naše teme je da nekontrolirana ili loše kontrolirana proizvodnja može dovesti do oslobađanja kontaminiranih pripravaka inzulina, što pak može dovesti do štetnih kliničkih posljedica.

Svrha ovog rada je proučavanje metoda koje se koriste u kontroli kvalitete inzulina.

reference

GOST R 52249-2004 "Pravila za proizvodnju i kontrolu kvalitete lijekova" 2004

OFS 42-0002-00 “Bakterijski endotoksini” 2000

OFS 42-0126-09 "Biološko ispitivanje inzulina"

Farmakopejski članak Ruske Federacije FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Genetski inženjering humanog inzulina: uspjesi i perspektive // Ruski kemijski časopis. - 2005. - T. XLIX. - 1. - str.

Goncharenko G.G. Osnove biotehnologije: Metoda poučavanja. kompleks za stud.biolog. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. arr. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 str.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Primjena kinetičko-kromogene metode za određivanje bakterijskog endotoksina (LAL-test) u tehnologiji pročišćavanja genetički modificiranog ljudskog inzulina // Biopharmaceutical journal - 2009. - Vol. - №1. - str.